| 研究課題/領域番号 |
24580413
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 秋田県立大学 |
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研究代表者 |
小林 正之 秋田県立大学, 生物資源科学部, 准教授 (50211909)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | マウス / 初期発生 / 細胞分化 / ホメオタンパク質 / 転写因子 |
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| 研究概要 |
1. 本研究の目的は、マウス胚において発見した新規転写因子EGAM1ホメオタンパク質群（3種）の胚発生における本質的な役割と標的遺伝子の全体像を解明し、胎仔と胚体外組織（胎盤と卵黄嚢）の形成や細胞機能を制御する新たな分子基盤を確立することである。平成24年度は、2.マウス胚においてEGAM1ホメオタンパク質群遺伝子をノックダウンするための準備研究、3.EGAM1ホメオタンパク質群により直接的に転写調節される標的遺伝子を網羅的に同定するための準備研究、4.EGAM1ホメオタンパク質群の機能ドメインに関する研究、を行った。
2. マウス胚の発生におけるEGAM1ホメオタンパク質群の機能を明らかにするために、アンチセンスモルフォリノオリゴを使った標的mRNA発現のノックダウンマウス胚を作製するための基盤技術を開発した。FITC標識モルフォリノオリゴと遺伝子導入試薬Endo-Porterをマウス初期胚と37℃で保温したところ、3時間以内に効率的に細胞内に取り込まれることが判明した。
3. EGAM1ホメオタンパク質群により発現量が変動するmRNAをcDNAマイクロアレイ法により網羅的に同定することにより、当該タンパク質群の直接的な標的遺伝子（候補）のカタログ化を行った。当該タンパク質群を強制発現させたマウスES細胞株を樹立し、それぞれから調製したcDNA、および対照ES細胞から調製したcDNAを用いてマイクロアレイ分析に供したところ、mRNA発現量が変化する多数の遺伝子を同定することに成功した。
4. EGAM1ホメオタンパク質群は核に局在すること、C末端側のホメオドメイン内に核移行シグナルが存在すること、核移行には適切なコンフォメーションの維持が重要であること、が明らかになった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
FITC標識モルフォリノオリゴを使った標的mRNA発現のノックダウン胚を作製するための基盤技術を開発することができた。EGAM1ホメオタンパク質群により発現量が変動するmRNA群のカタログ化は1年前倒しで行ったが、そのかわり，Chip-Seq法を用いて当該タンパク質群が結合するプロモーターDNAを網羅的に調べる実験計画は次年度以降に持ち越した。EGAM1ホメオタンパク質群の機能ドメインに関する研究の一部を前倒しで行い、重要な知見を得ることが出来た。所期の目標設定に照らしてみて、これらの進捗状況は適切である。
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| 今後の研究の推進方策 |
1. マウス胚の細胞運命の決定におけるEGAM1ホメオタンパク質群の関与を明らかにするために、平成24年度に確立した基盤技術を応用して、アンチセンスモルフォリノオリゴを使って標的mRNA発現を個ノックダウンした胚を作製する。マウス1細胞期卵を受精後5日まで培養し、形態的に異常がおこる胚の出現頻度を対照と比較する。胚を免疫染色してマーカータンパク質を検出し、内部細胞塊（マーカーはNANOG）・栄養外胚葉（CDX2）・原始内胚葉(GATA6)の形成不全や細胞数の増減がおこるか定量的に調べ、当該タンパク質群の役割を直接的に解明する。当該研究を遂行するために、H24年度から繰り越した研究費も充当する予定である。
2. 樹立済の当該タンパク質群を個別に強制発現させたES細胞より、Chip法を用いて当該タンパク質群結合ゲノムDNA領域（プロモーターDNA）を精製する。次に、小型次世代シークエンサーによりゲノムDNA領域の塩基配列を網羅的に決定後、どの遺伝子のプロモーターDNAに結合したのかデータベースと照合して同定する。EGAM1ホメオタンパク質群の直接的な標的遺伝子を見つけるために、当該タンパク質群が結合するプロモーターDNAをChip-Seq法により網羅的に調べる。当該研究を遂行するために、H24年度から繰り越した研究費も充当する予定である。
3. EGAM1ホメオタンパク質群による転写調節メカニズムを明らかにするために、当該タンパク質群と直接的に結合する転写因子を同定する。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
H24年度において、マウス初期胚へのモルフォリノオリゴ導入に係る基盤技術の確立、ならびにアンチセンスモルフォリノオリゴによるノックアウトマウス胚の作成を予定していた。基盤技術の確立について詳細な検討を行った後、後者の実験はH25年度に行うことにした。従って、H25年度の研究費とあわせてH24年度から繰り越した研究費も充当する。
当初、H25年度に実施予定であったマイクロアレイ解析実験をH24年度に前倒しで行った。そのかわり、Chip-seq法を用いた実験をH25年度に移動した。従って、H25年度の研究費とあわせてH24年度から繰り越した研究費も充当する。
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