高速相同配列検索プログラムとｄｅｅｐシーケンシング分析による網羅的ウイルス検出

2014 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 24580430
• 研究機関: 酪農学園大学
• 研究代表者: 遠藤 大二 酪農学園大学, 獣医学群, 教授 (40168828)
• 研究分担者: 水谷 哲也 東京農工大学, 農学部, 教授 (70281681)
• 研究期間 (年度): 2012-04-01 – 2015-03-31
• キーワード: 縮重塩基プライマー / 網羅的ウイルス検出 / 網羅的細菌検出 / 次世代シーケンス / プライマー設計プログラム / グリーディーアルゴリズム / 高速塩基配列整列 / 高速塩基配列相同性検索

研究実績の概要

前年度までの試行から、① 次世代シーケンスの配列分析では64倍以上の増幅であれば有意に検出できる　② PCR増幅反応が次世代シーケンス用試料中で効果的に進行するためには30サイクルの増幅で増幅産物が目視できるような増幅反応の特異性が必要になる　③ PCRの増幅反応が他の増幅反応に影響し始めるのは1,000倍程度以上増幅してからである ④ 多くの臨床データでは病原体検出の対象はウイルスのみではなく、細菌の検出も求められる。ということが判明した。これらの前提に対応するため、試料中からウイルスだけではなく細菌をPCRにより増幅可能なプライマーセットを網羅的に設計するため、下記の点でプライマー設計プログラムを全面的に改善した。
1 多数のウイルスおよび細菌遺伝子でプライマーを設計するため、相互の相同性を元に相互に相同性の高い遺伝子のクラスターを自動生成し、遺伝子配列を整列する。2 整列された遺伝子配列を元にそれらの90%と一致する縮重塩基を含むプライマーを設計した。3 プライマー設計対象遺伝子を持つウイルスまたは細菌種の数が最大となるように遺伝子クラスターを選択した。その際にはグリーディーアルゴリズムを利用した。4 最低数のプライマーで最大種数のウイルスおよび細菌が増幅可能なプライマーセットにより増幅されたウイルスおよび細菌遺伝子を検出するため、次世代シーケンス用メタゲノム解析プログラムを作成した。
この過程によって作成されたウイルスおよび細菌プライマーにより糞便抽出DNA中のウイルスおよび細菌の遺伝子を増幅し、次世代シーケンスのリード中のウイルスおよび細菌遺伝子の検出を試みた。この試行により、非増幅メタゲノム分析に比べウイルスおよび細菌の検出効率が高い遺伝子検出システムが作出された。

研究成果

• [雑誌論文] Use of S1 nuclease in deep sequencing for detection of double-stranded RNA viruses. (2015)
  • 著者名/発表者名: Shimada S, Nagai M, Moriyama H, Fukuhara T, Koyama S, Omatsu T, Furuya T, Shirai J, MizutaniT.
  • 雑誌名: J Vet Med Sci.(in press) 巻: Advance Publication ページ: On line
  • DOI: 10.1292/jvms.14-0607
  • 査読あり
• [雑誌論文] Identification, characterization, and full-length sequence analysis of a novel double-stranded RNAvirus isolated from an arboreal ant, Camponotus yamaokai. (2015)
  • 著者名/発表者名: Koyama S, Urayama SI, Ohmatsu T, Sassa Y, Sakai C, Takata M, Hayashi S, Nagai M, Furuya T, Moriyama H, Satoh T, Ono SI, Mizutani T.
  • 雑誌名: J Gen Virol. 巻: 96 ページ: On line
  • DOI: 10.1099/vir.0.000126
  • 査読あり
• [雑誌論文] Characterization of self-assembled virus-like particles of Merkel cell polyomavirus. (2015)
  • 著者名/発表者名: Li TC, Iwasaki K, Katano H, Kataoka M, Nagata N, Kobayashi K, Mizutani T, Takeda N, Wakita T, Suzuki T.
  • 雑誌名: PLos One 巻: 468 ページ: 524-531
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0115646
  • 査読あり
• [雑誌論文] Detection of enterovirus genome sequence from diarrheal feces of goat. (2014)
  • 著者名/発表者名: Omatsu T, Tsuchiaka S, Hirata T, Shiroma Y, Okazaki S, Katayama Y, Oba M, Nishiura N, Sassa Y, Furuya T, Nagai M, Ochiai H, Tamaki S, Mizutani T.
  • 雑誌名: Virus Genes 巻: 48 ページ: 550-552
  • DOI: 10.1007/s11262-014-1057-9
  • 査読あり
• [雑誌論文] Identification of novel bovine group A rotavirus G15P[14] strain from epizootic diarrhea of adult cows by de novo sequencing using a next-generation sequencer. (2014)
  • 著者名/発表者名: Masuda T, Nagai M, Yamasato H, Tsuchiaka S, Okazaki S, Katayama Y, Oba M, Nishiura N, Sassa Y, Omatsu T, Furuya T, Koyama S, Shirai J, Taniguchi K, Fujii Y, Todaka R, Katayama K, Mizutani T.
  • 雑誌名: Vet Microbiol. 巻: 171 ページ: 66-73
  • DOI: 10.1016/j.vetmic.2014.03.009
  • 査読あり
• [雑誌論文] Characterization of a genetic and antigenic variant of avian paramyxovirus 6 isolated from a migratory wild bird, the red-necked stint (Calidris ruficollis). (2014)
  • 著者名/発表者名: Bui VN, Mizutani T, Nguyen TH, Trinh DQ, Awad SS, Minoungou GL, Yamamoto Y, Nakamura K, Saito K, Watanabe Y, Runstadler J, Huettmann F, Ogawa H, Imai K.
  • 雑誌名: Arch Virol. 巻: 159 ページ: 3101-3105
  • DOI: 10.1007/s00705-014-2162-8
  • 査読あり
• [雑誌論文] Molecular, biological, and antigenic characterization of a Border disease virus isolated from a pig during classical swine fever surveillance in Japan. (2014)
  • 著者名/発表者名: Nagai M, Aoki H, Sakoda Y, Kozasa T, Tominaga-Teshima K, Mine J, Abe Y, Tamura T, Kobayashi T, Nishine K, Tateishi K, Suzuki Y, Fukuhara M, Ohmori K, Todaka R, Katayama K, Mizutani T, Nakamura S, Kida H, Shirai J.
  • 雑誌名: J Vet Diagn Invest. 巻: 26 ページ: 547-552
  • DOI: 10.1177/1040638714541837
  • 査読あり
• [雑誌論文] Detection of Japanese eel endothelial cells-infecting virus (JEECV) in the Japanese eel Anguilla japonica (Temminck & Schlegel), living in natural habitats. (2014)
  • 著者名/発表者名: Okazaki S, Manabe H, Omatsu T, Tsuchiaka S, Yamamoto T, Chow S, Shibuno T, Watanabe K, Ono S, Kuwada H, Mizutani T.
  • 雑誌名: J Fish Dis. 巻: 173 ページ: 136-140
  • DOI: 10.1111/jfd.12294
  • 査読あり
• [学会発表] アカバネウイルスによるアポトーシスメカニズムの解明 (2014)
  • 著者名/発表者名: 三友俊平、長井誠、大松勉、古谷哲也、岡崎祥子、土赤忍、水谷哲也
  • 学会等名: 第157回日本獣医学会学術集会
  • 発表場所: 北海道札幌市 北海道大学
  • 年月日: 2014-09-09 – 2014-09-12
• [学会発表] コウモリマルヒメダニから分離された新規ブニヤウイルスについて (2014)
  • 著者名/発表者名: 大場 真己、大松 勉、安藤 秀二、川端 寛樹、高野 愛 4、片山 幸枝、 古谷 哲也、長井 誠、水谷 哲也
  • 学会等名: 第157回日本獣医学会学術集会
  • 発表場所: 北海道札幌市 北海道大学
  • 年月日: 2014-09-09 – 2014-09-12
• [学会発表] G 15P［14］遺伝子型A群ロタウイルス（RVA）による搾乳牛の下痢症 (2014)
  • 著者名/発表者名: 増田恒幸、山里比呂志、水谷 哲也、長井 誠、片山 和彦
  • 学会等名: 第157回日本獣医学会学術集会
  • 発表場所: 北海道札幌市 北海道大学
  • 年月日: 2014-09-09 – 2014-09-12
• [学会発表] 日本で分離されたG3およびG14型ウマロタウイルスの全ゲノム解析 (2014)
  • 著者名/発表者名: 根本 学、長井 誠、恒光 裕、大松 勉、白井 淳資、近藤 高志、藤井 克樹、戸高 玲子、片山 和彦、水谷 哲也
  • 学会等名: 第157回日本獣医学会学術集会
  • 発表場所: 北海道札幌市 北海道大学
  • 年月日: 2014-09-09 – 2014-09-12
• [学会発表] 新規遺伝子型トリボルナウイルス（ABV-BF）の解析 (2014)
  • 著者名/発表者名: 佐々 悠木子、堀江 真行、鈴木 研太、加藤 真樹、香川 紘子、鈴木 和彦、 渋谷 淳、Chanathip Thammakarn、竹原 一明、古谷 哲也、本田 知之、 朝長 啓造、岡ノ谷 一夫、水谷 哲也
  • 学会等名: 第157回日本獣医学会学術集会
  • 発表場所: 北海道札幌市 北海道大学
  • 年月日: 2014-09-09 – 2014-09-12