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本研究は、ボツリヌス毒素が腸管細胞に結合し取り込まれる際に惹起されるシグナルの同定とその分子機構の解明を目的としている。本年度は、毒素の細胞への取り込みに関与する細胞内分子を明らかにすることを試みた。
細胞への毒素の取り込みに関与する細胞内分子を調べるため、細胞を各種阻害剤で処理した。アクチンフィラメントの関与を調べるためにCytochalasin B、微小管の関与を調べるためにNocodazole、細胞膜に局在しているコレステロールの関与を調べるためにMβCDを用いた。またククラスリン依存性エンドサイトーシスの阻害剤としてChlorpromazine-HCl、カベオラ依存性エンドサイトーシスの阻害剤としてFilipin complexを用いた。ラット小腸上皮細胞(IEC-6)を、24穴の培養プレートにコンフルエントに培養し、細胞に各種阻害剤を30分作用させた。BoNTおよびL-TCのトランスサイトーシスに寄与する細胞内分子を検討するため、阻害剤を用いたBoNTおよびL-TCの細胞結合および取り込み試験を行った。
L-TCの結合量は、いずれの阻害剤を用いた場合も対照群に比べ変化は認められなかった。L-TCの取り込み量は細胞膜局在コレステロールを除去するMβCDおよびクラスリン形成を阻害するクロルプロマジンによって抑制された。以上の結果から、D型L-TCは細胞コレステロールに富んだ部位からのクラスリン依存性エンドサイトーシスによって取り込まれることが示唆された
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