| 研究課題/領域番号 |
24580451
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 北海道医療大学 |
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研究代表者 |
岡崎 克則 北海道医療大学, 薬学部, 教授 (90160663)
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| 研究分担者 |
大澤 宜明 北海道医療大学, 薬学部, 講師 (20415558)
菅野 徹 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構, その他部局等, その他 (80355205)
井上 恵美 北海道医療大学, 薬学部, 助教 (80433423)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 地方病性牛白血病 / 牛白血病ウイルス / Tax / 診断 / ワクチン |
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| 研究概要 |
地方病性牛白血病の原因である牛白血病ウイルス（BLV）は既に国内のウシ間に蔓延しているが、白血病の発症は5～8歳に多く、ウイルス感染牛の数％に限られる。しかしながら、近年その報告は急増しており対策が急務となっている。そこで、本研究では白血病の発生制御に資するため、感染牛の摘発・淘汰に応用可能な予後診断法を開発すること、ならびに弱毒生ワクチン株を開発することを目的とした。
白血病野外材料のtax遺伝子の塩基配列を解析し、さらに申請者らが開発したmultiplex PCRによって400検体以上の材料を型別して各々の宿主牛の発症年齢を比較した。その結果、233番アミノ酸がLeuのTaxをコードするBLV（L233-Tax）に感染していた動物の発症年齢とP233-Tax感染牛の発症年齢の頻度分布は対数正規分布し、その相乗平均はP233-Taxで22ヶ月高い（ｐ＜0.01）ことがわかった。この成績は、生後間もなくに感染したウシのみが白血病を発症することを示唆し、さらに、P233-Taxでは潜伏期が約2年間長いことを示す。したがって、本PCRは感染牛の摘発・淘汰に適した予後診断法であることが明らかになった。
白血病の早発例（6ヶ月齢）と晩発例（18歳）について、プロウイルスの全塩基配列を決定した。その結果、早発例ではTaxの100番アミノ酸にPro→Ser変異が認められ、晩発例では2クローンのプロウイルスのうち一方で逆転写酵素のC末側（RNaseHドメイン）に欠損が認められた。逆転写酵素の部分欠損ではドミナントネガティブな増殖抑制が生じている可能性が想定され、弱毒生ワクチンへの応用が期待できる。
弱毒生ワクチンの開発ならびに潜伏期に関する仮説を実証するため、BLV感染性クローンの作出を試みた。プロウイルスを4断片に分割してPCRを実施したが、第2断片の増幅が未達である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
BLV tax遺伝子の解析に基づく予後診断法の開発ならびに弱毒生ワクチン開発に向けた新知見の獲得では、当初の計画を大きく上回り進展している。一方、感染性クローンの作出は年度内に達成できなかった。そのため、ヒツジでの感染実験は開始できていない。
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| 今後の研究の推進方策 |
1. 15歳以上の晩発症例由来プロウイルスの全ゲノム解析を継続し、白血病の発症遅延に働く変異を明らかにする。
2. 申請者らの実施した調査では白血病由来BLVは全てA96-Taxであったのに対し、データベース上の未発症BLV感染牛では高率にV95-Taxが認められる。そこで、未発症牛の血液材料を収集して感染プロウイルスの95番アミノ酸を調べる。本アミノ酸と白血病発症の関連を明らかにするため、追跡可能な個体についてコホート解析を開始する。また、233番アミノ酸と同様の簡易判別法を開発する。
3. 欠損逆転写酵素の発現系を構築してBLV持続感染細胞で発現させ、産生ウイルス量を測定することによって欠損逆転写酵素によるドミナントネガティブ効果を実証する。
4. 感染性クローンを作出して種々の変異体を調整し、ヒツジへの感染実験を実施する。得られる成績から弱毒生ワクチンの候補株を選定する。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
24年度は、遺伝子解析に必須なオートシークエンサーのレーザー管の交換費として本来ヒツジの購入に充てる計画であった予算を支出した。次年度以降のヒツジ購入に備えて繰越した研究費は、感染実験の準備が整い次第、ヒツジ購入およびその飼養費に充てる予定である。
感染実験の準備が整わない場合は、遺伝子解析関連の試薬に支出するとともに、後のヒツジ購入に備えて一定額を繰越す。
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