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医薬品のアレルゲン性試験に関して準拠すべき指針は無く、また、信頼性の高い試験法も無いことから、ヒトにおけるアレルゲン性を効率的に予測可能な試験法の開発が熱望されている。そこで本研究では、ヒト単球由来のTHP-1細胞を用いて、医薬品に対する簡便なin vitroアレルゲン性試験法を確立するための基盤的研究を行うことを目的とした。本年度は、昨年度樹立したCYP3A4安定発現株のさらなる解析を行った。また、昨年度樹立したレポータージーンアッセイ用安定発現株に関しては、感作性物質応答性は見られたものの、細胞増殖能が低く、アッセイ系への適用が困難であることが判明した。そこで、CD86およびCD54の遺伝子発現量をリアルタイムRT-PCR法にて評価する系の開発を行った。
1. CYP3A4安定発現株（THP-1/3A4）の特性解析
P450-Glo CYP3A4 Assayキットを用いたTHP-1/3A4細胞の活性シグナルが、CYP3A4の阻害剤であるketoconazoleにより阻害されたことから、その活性シグナルはCYP3A4の活性であることが確認できた。また、代謝活性化を考慮するうえで必要な、他の薬物代謝酵素の活性についても測定を行った結果、スルホトランスフェラーゼ活性が認められた。
2. CD86およびCD54を指標としたリアルタイムRT-PCR法によるアレルゲン性評価系
被験物質として、感作性物質および非感作性物質を用い、細胞生存率が75％となる濃度でTHP-1細胞に暴露し、24時間後に細胞を回収後、アルタイムRT-PCR法にてマーカー分子であるCD86およびCD54の発現量を解析した。アレルゲン性の評価は、GAPDHを内在性コントロールとし、溶媒のみの暴露時に対するマーカー分子の相対発現量をΔΔCq法により算出し、感作性物質を陽性、非感作性物質を陰性として検出可能な系を作出した。
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