研究課題
近年、覚醒剤精神病モデル動物の脳内において遺伝子発現量が増加する分子としてShatiが見出された。しかしながら、Shatiの生理的機能やその役割については、ほとんど明らかにされていない。そこで、本研究では、各種Shati遺伝子改変マウスを用いて、その機能的役割を明らかにするとともに、精神疾患の診断や遺伝子治療の可能性を検討する。我々の海外共同研究グループは、ShatiがN-acetylaspartate（NAA）の合成酵素であること、更にNAAはN-acetylaspartylglutamate（NAAG）へと縮合されることを報告した。そこで、本年度はまず、各種Shati遺伝子改変マウスにおけるNAAおよびNAAG含量を測定した。Shati欠損マウスの脳内では、NAA含量が有意に減少し、NAAGはほとんど検出されなかった。アデノ随伴ウイルスベクターを用いた側坐核または海馬Shati過剰発現マウスでは、各脳部位におけるNAAおよびNAAG含量が有意に増加していた。次に、NAAGが代謝型グルタミン酸受容体3（mGluR3）の神経伝達物質であることに着目して、行動薬理学的、生化学的および電気生理学的検討を行った。その結果、昨年度に見出した各種Shati過剰発現マウスにおける行動学的異常が、mGluR3拮抗薬の投与によって改善された。さらに、野生型マウスの側坐核におけるドパミン基礎遊離量は、NAAG処置またはNAAG分解酵素阻害剤の投与によって、側坐核Shati過剰発現マウスと同様に有意に減少した。また、野生型マウスの海馬スライスへのNAAG処置は、海馬Shati過剰発現マウスでの認知機能亢進を支持し、シナプス可塑性（長期増強）の有意な増加が観察された。以上のことから、Shatiは、mGluR3を介したグルタミン酸作動性神経システムを機能調節することによって、情動性や学習記憶に重要な役割を果たしていることが明らかとなった。
2: おおむね順調に進展している
前述したように、本年度は、行動薬理学的、生化学的および電気生理学的手法によって、Shatiが調節する神経制御メカニズムを解明し、その機能的役割を明らかにした。また、精神病様症状を引き起こす覚醒剤投与によるShati遺伝子発現メカニズムをin vitro およびin vivo実験で検討した。培養細胞を用いたShatiゲノムDNAのレポーター解析によって、Shatiプロモーター領域が推定されたため、in silico 検索による転写因子結合配列の解析を行った。その結果、発現調節に重要と考えられる２つの配列を見出した。さらに、覚醒剤連続投与動物におけるShatiプロモーター領域のメチル化解析を行ったところ、対照群と比較して覚醒剤連続投与により側坐核および血中由来ゲノムDNAの同一箇所のメチル化率およびプロモーター領域全体の平均メチル化率が有意に減少していた。つまり、この結果は、Shati遺伝子発現が、少なからずDNAメチル化により調節されていることを明らかにするとともに、脳組織と血中のShati DNAメチル化率が連動している可能性を示唆した。そこで、本年度より、この現象を基に精神疾患の診断方法開発のために、富山大学附属病院精神科のご協力を得て、精神疾患患者からの血液サンプルの採集を開始した。以上のことから、本年度に予定していた実験計画のうち、各種Shati遺伝子改変マウスにおける行動学的神経機能変化を裏付けるための基礎実験は順調に遂行された。また、臨床応用のための礎となる基礎実験によって、その糸口を見出し、臨床実験に着手することができた。しかし、当初、予定していたShati相互作用分子の探索については、後述する研究施設の都合により着手することができなかった。
次年度は、まず、基礎実験として、Shatiと相互作用するタンパク質を同定する。そのために、GST-tag融合Shati 発現ベクターを利用したプルダウン・アッセイ法、電気泳動分離法およびMALDI-TOF/MS法もしくはLC-MS/MS法により、Shatiと結合するタンパク質を明らかにするとともに、その相互作用の意義を検討する。さらに、各種のShati遺伝子改変マウスを用いて、神経活動調節機能以外のShatiの機能も検討していく予定である。また、臨床実験においては、精神疾患患者から採集した血液サンプルをもとにShatiプロモーター領域のDNAメチル化率を解析するとともに、血中NAAおよびNAAG量の測定を試みる。これらの実験結果と、臨床確定診断での病名や程度を比較することによって、精神疾患状態を把握する診断方法開発の検討を行う。以上のことから、Shatiの更なる機能的役割を明らかにするとともに、精神疾患の診断応用への有用性を確立していく。
本年度は、昨年度より続く本学生命科学先端研究センター動物実験施設の改築工事および工事後のマウス飼育室移動の影響を極力減らすために、動物実験を優先して行った。そのため、in vitro実験であるShati相互作用分子の探索に着手できず、次年度使用額が生じた。また、当初、海外での学会において研究成果を発表する予定であったが、担当実習の都合により渡航できなくなったことも、その原因のひとつである。次年度に、消耗品費として、Shati 相互作用分子の探索ためのGST-tag融合タンパク質プルダウン・アッセイ、電気泳動およびMALDI-TOF/MSもしくはLC-MS/MS実験の試薬器具費に本年度の繰越金を使用する。また、精神疾患患者の血中Shati DNAメチル化解析の試薬器具費にも、繰越金を利用して次年度予算を充足する。その他、実験動物の飼育費、in vivo マイクロダイアリシス実験の試薬器具費、多電極細胞外電位記録実験の試薬器具費および一般試薬費での使用を予定している。
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Int. J. Neuropsychopharmacol.
巻: 印刷中 ページ: 印刷中
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日本神経精神薬理学雑誌
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http://www.pha.u-toyama.ac.jp/yakuchi
