| 研究課題/領域番号 |
24590266
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| 研究機関 | 旭川医科大学 |
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研究代表者 |
高井 章 旭川医科大学, 医学部, 教授 (50126869)
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| 研究分担者 |
宮津 基 旭川医科大学, 医学部, 講師 (40396346)
竹谷 浩介 旭川医科大学, 医学部, 助教 (20586862)
赤尾 鉄平 旭川医科大学, 医学部, 助教 (60399821) [辞退]
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | ムスカリン受容体 / 信号伝達 / GTAP結合蛋白 / 非選択性陽イオンチャネル / 毛様体筋 / 副交感神経 / 平滑筋 / 貯蔵量作動性カルシウムチ |
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| 研究実績の概要 |
本研究は、毛様体筋および瞳孔括約筋というほぼ純粋に副交感神経にのみ支配される恰好のモデル的な組織を実験材料に選び、遺伝子ノックダウン培養細胞系や遺伝子改変マウスを利用して、ムスカリン受容体作動性の非選択性陽イオンチャネル(NSCC)およびその調節系の分子実体を解明することを目標として実施した。
前二年度にひきつづき、ウシ毛様体筋組織から健常な筋細胞を効率よく分離する方法の改良を続けた。その結果、コラゲナーゼ処理により分散させた毛様体筋サンプルを、1.050 - 1.060 g/mL非連続Percoll濃度勾配(1.050-1.060 g/mL)中で遠心分離にかけ、濃度界面に集まった部分を取り出してセルソータで分離するという方法に到達した。この手順により、牛眼1個分の毛様体筋組織から、一度に5 x 10^6個の筋細胞を、他の細胞や組織断片など夾雑物のない状態で得ることができるようになった。
この方法で得られた細胞を用いた実験により、ウシ毛様体筋細胞には、M3 型アセチルコリン受容体とA型エンドセリン受容体が、同一の毛様体筋細胞の細胞膜に共存し、Gq/11と共役する共通の信号伝達経路を介して、NSCCの開口を調節することが明らかになった。
一方、TRPC3およびTRPC6のノックアウトマウスを用いた実験を行った。微小筋束を用いた等尺性張力記録、fluo-4を用いた細胞膜電流記録、蛍光抗体を用いた蛋白局在の可視化に加え、超遠心による膜分画採取などの方法を駆使した実験が、微小なマウス材料でも安定的に実行できることを確認した。今後、他のTRPCやTIM1/Orai1の遺伝子改変動物にも同様の手法を適用して、NSCCS/L分子本体の探索をつづける予定である。
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