| 研究課題/領域番号 |
24590267
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
村田 喜理 東北大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (60455780)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | イオンチャネル / 小胞体 |
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| 研究概要 |
我々の研究室独自の技術として確立している、単離した核周辺小胞体 (nuclear envelope) 標本における電気生理学的記録から、Ca2+依存性の電位依存性K+チャネル (KCa1.1) の小胞体膜に対する配向が、現在一般に受け入れられている小胞輸送機構から予測されるものとは逆であることが示唆された。これは、現在知られる小胞輸送機構では説明できず、未知の小胞輸送機構の存在が疑われる非常に興味深い現象である。本申請ではこの現象に着目し、小胞体膜中では通常と異なる配向を持ちながら、形質膜では通常の配向を示す、KCa1.1チャネルの小胞体膜への埋め込み、形質膜への輸送のメカニズムを検討するとともに、その機構に必要とされる、細胞内因子の探索と機能解析を行う。
本年度は、まず、KCa1.1チャネルの小胞体膜中における配向を、電気生理学的手法以外の方法で確認することを目的に実験を行った。核周辺小胞体標本における免疫染色、KCa1.1チャネルの糖鎖修飾部位を同定する実験を行う予定であったが、異なる実験手法を立案、遂行した。
タバコモザイクウィルス由来のTEVプロテアーゼは、タンパク質中の特異的なアミノ酸配列（TEVプロテアーゼ認識配列）を認識し切断するタンパク質分解酵素である。KCa1.1タンパク質のC末端に、TEVプロテアーゼ認識配列をリンカーにして緑色蛍光タンパク質EGFPを付加した融合タンパク質を作成し、HEK293細胞にTEVプロテアーゼとともに発現させた。KCa1.1が従来と逆の配向で小胞体膜上に存在する場合、小胞体膜内にあるリンカー部分が保護され、細胞質にあるTEVプロテアーゼによる消化をうけない。融合タンパク質のTEVプロテアーゼによる消化の有無は、SDS-PAGEとウェスタンブロットにより確認し、現在までに、従来と逆の配向を示す予備的な実験結果を得ている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
実験手法を変更したものの、予定通り、電気生理学的手法以外の方法で小胞体膜上のKC1.1の配向を確認するめどがつきつつある。
当初の計画通り、平成25年度までに、小胞体膜上でのKCa1.1チャネルタンパク質の配向を同定しようと試みている。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成24年度に着手した生化学的解析を引き続き行うとともに、小胞体膜上のKCa1.1の小胞体膜上の配向について、電気生理学的手法によりさらに詳細な解析を行う予定である。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
実験手法の変更により生じたものである。
平成25年度以降の研究費とともに、有効に使用する。
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