研究課題
研究期間全体を通じて実施した研究の成果：(1)マウス胎仔を用いたホールマウントin situハイブリダイゼーション解析により、Elongin A(EloA)の欠失で神経堤細胞から感覚神経への分化制御過程が損なわれることで神経系の形成不全が起こることが、(2)レチノイン酸(RA)による神経分化誘導前後の胚様体を用いたクロマチン免疫沈降(ChIP)解析により、EloAは、神経形成に関わるNeurogenin 1等の幾つかの遺伝子のRAによる発現誘導に寄与していることが判明し、EloAが神経堤細胞の分化を指令するNeurogenin1等の転写制御因子の発現を促進することにより感覚神経系の形成に関与していることが示唆された(Cell Reports 2: 1129-1136, 2012)。また、神経分化における遺伝子発現の経時的変化を調べるために、胚様体を用いてRNAシークエンスを行ったところ、EloAの欠失により神経分化に関わる幾つかのlong non-coding RNAの発現も顕著に減少していることが判明した。さらに、これまでChIPに適した抗EloA抗体がなかったため、EloAのアミノ酸配列の親水性ならびに二次構造予測データに基づいて新たに抗原部位を6カ所選定し、ウサギを用いて当該部位に対する抗体作製を行った。抗体を精製した後、免疫染色、免疫沈降によりChIP用抗体の候補として4種類の抗体を得た。最終年度は、さらにChIPに適した抗体の選別を行うために、FLAG-EloAをトランスフェクションした293T細胞ならびにESを用いて、UV照射前後の細胞よりクロマチン画分を調製しChIPを行い、FLAG-EloAならびに内在性EloAとRNAポリメラーゼIIを共免疫沈降可能な抗体を選定した。その結果2種類の抗体が、高効率にPol IIを共免疫沈降できることを確認した。
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