虚血誘導性Ｇ蛋白活性調節因子を介する病態制御機構の解明

2012 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 24590280
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 研究機関: 愛知医科大学
• 研究代表者: 佐藤 元彦 愛知医科大学, 医学部, 教授 (40292122)
• 研究分担者: 西村 直記 愛知医科大学, 医学部, 講師 (40278362) ; 佐藤 麻紀 愛知医科大学, 医学部, 助教 (60351102)
• 研究期間 (年度): 2012-04-01 – 2015-03-31
• キーワード: シグナル伝達 / Ｇ蛋白質 / 心筋保護 / 循環器・呼吸器

研究概要

GST融合蛋白を用いたAGS8のＧβγ作用部位の同定：AGS8の各領域をGST融合蛋白として大腸菌で作製し、精製Ｇβγと直接結合するかをpull-down assayで検討した。AGS8は200ｋｄに及ぶ蛋白であるので、大腸菌内で生成されやすい30-40kdの大きさに6分割し、それぞれの小部分をGST融合蛋白として作製した。６つのGST融合蛋白はどれも大腸菌内で合成可能で、可溶化蛋白として精製することができた。これらを用いてＧβγサブユニットが結合する部分をGST pull-downアッセイ法を用いて検討したところ、AGS8の中間部とC端にＧβγサブユニットが結合することが明らかになった。しかし、AGS8中間部のＧβγサブユニット結合部は細胞に導入しても、Ｇ蛋白シグナルを惹起しなかった。他方、AGS8-C端のＧβγサブユニット結合部は細胞内シグナルを惹起することがすでに明らかになっている（Sato M, et al. J Biol Chem. 2009;284:31431.）。そこで、以後の研究はAGS8のC端部位に注目しこの部分をさらに5分割しそれぞれの小部分をGST融合蛋白として作製した。５つのGST融合蛋白はどれも大腸菌内で合成可能で、可溶化蛋白として精製することができた。再度、GST pull-downアッセイ法を用いてＧβγサブユニット結合部分を検討したところ検討したところ、Ｇβγサブユニット結合部分は11-17kd(100-150アミノ酸)程度の範囲に絞ることができた。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

平成２４年度当初に予定した計画はすべて達成することができた。ＧＳＴ蛋白質は大腸菌内で生成されない、あるいは可溶化されない場合があるが、今回のＧＳＴ蛋白はすべて順調に作製することができた。また、作製蛋白を用いたpull-down assayによるＧβγサブユニット結合部分の同定も明快な結果が得られている。

今後の研究の推進方策

AGS8上のＧβγ結合部位の特定とAGS8-Ｇβγ相互作用阻害ペプチド（AGS8関連ペプチド）の開発
1．AGS8-Ｇβγ相互作用を抑制するペプチドの同定：平成２４年度の検討で同定された、AGS8-Ｇβγ相互作用部位のアミノ酸配列に基づくペプチドを複数作製し、in vitro pull-down assayでAGS8とＧβγサブユニットの相互作用を阻害するか検討する。作製するペプチドは比較的安定して合成可能な30アミノ酸以下のものを予定している。これにより、AGS8上のＧβγ相互作用部位を30アミノ酸程度に限定することが可能になると予想する。
２．AGS8-Ｇβγ相互作用を抑制する効率的なペプチドの作製：上記実験で同定した複数のペプチドを検討し、より強い阻害作用を持つものを見出す。さらに得られたペプチドを基に、細胞内への導入が有利なより短いペプチド（20アミノ酸程度）を作製し、これのAGS8-Ｇβγ相互作用阻害効果を検討する。

次年度の研究費の使用計画

本年度は研究実績に記載したとおりGST融合蛋白の作製が順調に進み、合成部位を変更しての再合成等が非常に少なかったため、合成に要する費用が軽減した。また、精製Ｇβγサブユニットを用いたGST pull-downアッセイも明快な結果が得られたため、試行回数が当初予定より少なくて済み、結果として精製Ｇβγサブユニットの購入量が少なくなり、これに要する費用が軽減した。
助成金は平成25年度分と合わせて、ペプチド合成に使用する予定である。今後の研究の推進方策に記載したペプチド合成は試行錯誤の部分があり、この部分に助成金を注力する。

研究成果

• [雑誌論文] Effects of water nanodroplets on skin moisture and viscoelasticity during air-conditioning. (2013)
  • 著者名/発表者名: Ohno H, Nishimura N, Yamada K, Shimizu Y, Iwase S, Sugenoya J, Sato M.
  • 雑誌名: Skin Research and Technology 巻: Vol. 19(4) ページ: 375-383
  • DOI: 10.1111/srt.12056
  • 査読あり
• [雑誌論文] Seasonal differences in melatonin concentrations and heart rates during sleep in obese subjects in Japan. (2013)
  • 著者名/発表者名: Sato Maki, Kanikowska D, Iwase, S, Shimizu Y, Nishimura N, Inukai Y, Sato M, Sugenoya J.
  • 雑誌名: International Journal of Biometeorology 巻: Vol. 57(5) ページ: 743-748
  • DOI: 10.1007/s00484-012-0601-3
  • 査読あり
• [雑誌論文] Comparison of fixation distances in middle-aged subjects. (2012)
  • 著者名/発表者名: Takada M, Uemoto K, Miyao M, Matsuura M, Sato Motohiko, Takada H.
  • 雑誌名: International Journal of Bioscience, Biochemistry and Bioinformatics 巻: 2(6) ページ: 389-394
  • DOI: 10.7763/IJBBB.2012.V2.145
  • 査読あり
• [雑誌論文] Effect of accommodation training on visual function of visual inspection workers and middle-aged people. (2012)
  • 著者名/発表者名: Takada M, Miyao M, Sato Motohiko, Yoshikawa K, Matsuura Y, Takada H.
  • 雑誌名: Journal of Sports Medicine & Doping Studies 巻: 2 ページ: 112
  • DOI: 10.4172/2161-0673.1000112
  • 査読あり
• [雑誌論文] Pharmacological stimulation of type 5 adenylyl cyclase stabilizes heart rate under both microgravity and hypergravity induced by parabolic flight. (2012)
  • 著者名/発表者名: Bai Y, Tsunematsu T, Jiao Q, Ohnuki Y, Mototani Y, Shiozawa K, Jin M, Cai W, Jin HL, Fujita T, Ichikawa Y, Suita K, Kurotani R, Yokoyama U, Sato Motohiko, Iwatsubo K, Ishikawa Y, Okumura S.
  • 雑誌名: Journal of Pharmacological Sciences 巻: 119(4) ページ: 381-389
  • DOI: 10.1254/jphs.12102FP
  • 査読あり
• [雑誌論文] Inhibition of phosphodiesterase type 3 dilates the rat ductus arteriosus without inducing intimal thickening. (2012)
  • 著者名/発表者名: Ichikawa Y, Yokoyama U, Iwamoto M, Oshikawa J, Okumura S, Sato Motohiko, Yokota S, Masuda M, Asou T, Ishikawa Y.
  • 雑誌名: Circulation Journal 巻: 76(10) ページ: 2456-2464
  • DOI: 10.1253/circj.CJ-12-0215
  • 査読あり
• [雑誌論文] Inhibition of EP4 signaling attenuates aortic aneurysm formation. (2012)
  • 著者名/発表者名: Yokoyama U, Ishiwata R, Jin MH, Kato Y, Suzuki O, Jin H, Ichikawa Y, Kumagaya S, Katayama Y, Fujita T, Okumura S, Sato M, Sugimoto Y, Aoki H, Suzuki S, Masuda M, Minamisawa S, Ishikawa Y.
  • 雑誌名: PLoS One 巻: 7(5) ページ: e36724, 20a
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0036724
  • 査読あり
• [雑誌論文] Effect of ascorbic acid on reactive oxygen species production in chemotherapy and hyperthermia in prostate cancer cells. (2012)
  • 著者名/発表者名: Fukumura H, Sato Motohiko, Kezuka K, Sato I, Feng X, Okumura S, Fujita T, Yokoyama U, Eguchi H, Ishikawa Y, Saito T.
  • 雑誌名: Journal of Physiological Sciences 巻: 62(3) ページ: 251-257
  • DOI: 10.1007/s12576-012-0204-0
  • 査読あり
• [学会発表] 心病態モデルで発現するG蛋白活性調節因子の同定と解析. シンポジウム 心臓・循環生理の新たな調節機構 ―三量体G蛋白シグナルの新コンセプト―（オーガナイザー：佐藤元彦, 黒瀬等）
  • 著者名/発表者名: 佐藤元彦, 鈴木洋子, 佐喜眞未帆, 岩瀬敏, 犬飼洋子, 西村直記, 佐藤麻紀, 清水祐樹.
  • 学会等名: 第90回日本生理学会大会
  • 発表場所: タワーホール船堀（東京都）
• [学会発表] 随意的筋収縮により誘発された皮膚交感神経活動への運動指令と視覚合図認知の寄与.
  • 著者名/発表者名: 桑原裕子, 塚原玲子, 高田真澄, 神谷美香, 岩瀬敏, 清水祐樹, 西村直記, 菅屋潤壹, 佐藤元彦.
  • 学会等名: 第90回日本生理学会大会
  • 発表場所: タワーホール船堀（東京都）
• [学会発表] 皮膚交感神経活動における発汗神経活動と血管収縮神経活動の時間依存性を考慮した識別.
  • 著者名/発表者名: 清水祐樹, 桑原裕子, 塚原玲子, 岩瀬敏, 西村直記, 菅屋潤壹, 佐藤元彦.
  • 学会等名: 第90回日本生理学会大会
  • 発表場所: タワーホール船堀（東京都）
• [学会発表] 心筋細胞におけるcAMPとCaのoscillationモデル.
  • 著者名/発表者名: 上出剛久, 佐藤元彦, 石川義弘.
  • 学会等名: 第90回日本生理学会大会
  • 発表場所: タワーホール船堀（東京都）
• [学会発表] 身体半側多汗の病態機序.
  • 著者名/発表者名: 犬飼洋子, 岩瀬敏, 西村直記, 佐藤麻紀, 清水祐樹, 桑原裕子, 菅屋潤壹, 佐藤元彦.
  • 学会等名: 第90回日本生理学会大会
  • 発表場所: タワーホール船堀（東京都）
• [学会発表] 肥満者におけるアディポサイトカインおよびホルモンの季節性変動.
  • 著者名/発表者名: 佐藤麻紀, Dominika Kanikowska, 岩瀬敏, 清水祐樹, 西村直記, 犬飼洋子, 菅屋潤壹, 佐藤元彦.
  • 学会等名: 第90回日本生理学会大会
  • 発表場所: タワーホール船堀（東京都）
• [学会発表] 糖転移ヘスペリジン摂取による下腿部浮腫の予防効果.
  • 著者名/発表者名: 西村直記, 岩瀬敏, 宅見央子, 山本敬子, 佐藤元彦.
  • 学会等名: 第90回日本生理学会大会
  • 発表場所: タワーホール船堀（東京都）
• [学会発表] Ross症候群におけるI-123 MIBG(metaiodobenzylguanidine)心筋交感神経シンチグラフィの検討.
  • 著者名/発表者名: 犬飼洋子, 岩瀬敏, 西村直記, 佐藤麻紀, 清水祐樹, 佐藤元彦, 丹羽淳一, 泉雅之, 高橋昭, 荻原真清.
  • 学会等名: 第135回日本神経学会東海北陸地方会
  • 発表場所: 名古屋国際会議場（愛知県）
• [学会発表] 環境温により体温が変動した2例の病態生理.
  • 著者名/発表者名: 犬飼洋子, 岩瀬敏, 清水祐樹, 西村直記, 桑原裕子, 菅屋潤壹, 佐藤元彦.
  • 学会等名: 第40回自律神経生理研究会
  • 発表場所: 日本光電（株）本社研修センター（東京都）
• [学会発表] 肥満者における睡眠中のメラトニン濃度と心拍数の季節性変動.
  • 著者名/発表者名: 佐藤麻紀, Kanikowska D, 岩瀬敏, 清水祐樹, 西村直記, 犬飼洋子, 佐藤元彦, 菅屋潤壹.
  • 学会等名: 第59回中部日本生理学会
  • 発表場所: 自然科学研究機構 岡崎カンファレンスセンター（愛知県）
• [学会発表] 体温調節異常が視床下部障害によると考えられた3例の病態生理.
  • 著者名/発表者名: 犬飼洋子, 岩瀬敏, 西村直記, 佐藤麻紀, 桑原裕子, 清水祐樹, 菅屋潤壹, 佐藤元彦.
  • 学会等名: 第59回中部日本生理学会
  • 発表場所: 自然科学研究機構 岡崎カンファレンスセンター（愛知県）