| 研究課題/領域番号 |
24590285
|
|---|
| 研究種目 |
基盤研究(C)
|
| 研究機関 | 東海大学 |
|---|
研究代表者 |
松田 純子 東海大学, 糖鎖科学研究所, 教授 (60363149)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2015-03-31
|
| キーワード | 上皮細胞 / 小腸 / スフィンゴ脂質 / セラミド / 生体膜 / 膜脂質 / 脂肪酸水酸化酵素 |
|---|
| 研究概要 |
小腸上皮細胞にはスフィンゴシン塩基のC4位と脂肪酸のC2位に一つずつ水酸基が多いフィトセラミド構造(t18:0/hFA)を持つスフィンゴ糖脂質が豊富に存在する。しかしその生物機能はほとんどわかっていない。我々は先行研究で、現在同定されている唯一の脂肪酸C2水酸化酵素Fatty acid 2-hydroxylase(FA2H)は、神経系の髄鞘には強く発現しているが、小腸には全く発現が認められないことを明らかにした。本研究は小腸上皮細胞に発現する新規の脂肪酸C2水酸化酵素を同定し、小腸上皮細胞におけるフィトセラミド構造(t18:0/hFA)の生物機能を解明することを目的としている。得られる成果は活発な消化吸収機能を担う小腸上皮細胞膜における膜脂質の機能解明や未知の疾患の発見、腸疾患の治療法開発につながる可能性がある。平成24年度は、小腸上皮細胞に発現する新規脂肪酸水酸化酵素の探索を行った。タンパク質配列のデーターベースを用いたモチーフ・ドメイン検索により脂肪酸水酸化酵素に共通のモチーフ配列を持ち、小腸での発現が高く、小胞体に局在するAlkylglycerol monooxygenase(AGMO)を候補遺伝子とした。Agmoの発現ベクターをCHO-K1細胞に導入してAgmoの安定発現株を得て、薄層クロマトグラフィー(TLC)による脂肪酸水酸化酵素活性測定を行ったが、活性を確認できなかった。検出感度が低かった可能性を考え、現在、より感度の高いガスクロマトグラフィーや安定同位体によるメタボリックラベリング法を用いた脂肪酸水酸化酵素活性測定の確立を行っている。また、小腸上皮細胞とオリゴデンドログリアの培養細胞間のマイクロアレイ遺伝子発現解析の結果を用いて、小腸上皮細胞に特異的に高発現している遺伝子群を網羅的に探索する計画を立てている。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
小腸上皮細胞に発現する新規の脂肪酸C2水酸化酵素の探索が遅れている。今回候補遺伝子としたAlkylglycerol monooxygenase(AGMO)はタンパク質配列のデーターベースを用いたモチーフ・ドメイン検索により脂肪酸水酸化酵素に共通のモチーフ配列を持ち、脳での発現が低いのに対して小腸での発現が高く、小胞体に局在することから、候補遺伝子として有望と考えたが、脂肪酸水酸化酵素活性を見出せなかった。今回のTLCの検出感度が低かった可能性を考え、現在、より感度の高いガスクロマトグラフィーや安定同位体によるメタボリックラベリング法を用いた脂肪酸水酸化酵素活性測定法の確立を行っている。一方、新規脂肪酸水酸化酵素遺伝子は既知の脂肪酸水酸化酵素に存在するモチーフ配列を持っていない可能性もあるため、小腸上皮細胞とオリゴデンドログリアの培養細胞間のマイクロアレイ遺伝子発現解析の結果を用いて、小腸上皮細胞に特異的に高発現している遺伝子群を網羅的に探索する計画を立てている。
|
| 今後の研究の推進方策 |
平成24年度は新規の脂肪酸C2水酸化酵素の同定に至らず、酵素の特性解析やノックアウトマウスの作成には着手できなかった為、平成25年度へ85万円の繰越しとなった。今後は、まず、高感度の脂肪酸水酸化酵素活性測定法の確立に取り組み、下記の研究を推進する。
1）小腸上皮細胞に発現する新規の脂肪酸C2水酸化酵素を同定し、酵素の活性、基質特異性、細胞内局在、発現分布などの特性を決定する。
2）同定した新規の脂肪酸C2水酸化酵素遺伝子のノックアウトマウスを作製する。まず、小腸と腎臓に着目し、小腸上皮細胞および尿細管上皮細胞の形態変化、機能変化を解析する。さらに、スフィンゴシンのC4位の水酸基(t18:0)を欠損している、dihydroceramide:sphinganine C4-hydroxylase(DES2) ノックアウトマウス(Des2-KO)との交配実験により、セラミド骨格の2か所の水酸基を共に欠損したダブルノックアウトマウスを作製し表現型解析を行う。
3)各ノックアウトマウスから、小腸上皮細胞の培養細胞を樹立し、共焦点顕微鏡を用いたFRAP(Fluorescence Recovery After Photo bleaching)解析などにより、膜の流動性や、膜タンパク質の動態解析を行う。
4) 上記の研究により明らかになったマウスの表現型をもとにヒトのフィトセラミド構造(t18:0/hFA)欠損症の存在を推定し、新たな疾患の検索を行う。
|
| 次年度の研究費の使用計画 |
平成24年度は新規脂肪酸C2水酸化酵素の特性解析やノックアウトマウスの作成に至らなかった為、それに必要な経費約85万円が次年度へ繰越しとなった。平成25年度は、2つの課題、1）小腸上皮細胞に発現する新規の脂肪酸C2水酸化酵素の同定と特性解析、2）同定した新規の脂肪酸C2水酸化酵素遺伝子のノックアウトマウスの作製、に取り組み、繰越額85万円を加えた助成金のうち、1)に40%、2)に60%の物品費の使用を予定している。
|
