研究課題
アルツハイマー病脳やアルツハイマー病モデルマウス脳では、発症の物質的基盤となるアミロイドβペプチド（Aβ）の細胞外における重合沈着が観察され、アミロイド斑を形成する。脳内のミクログリア細胞はその貪食作用によりアミロイド斑を除去する作用を示す。しかし、アルツハイマー病脳では細胞外分子ヘパラン硫酸糖鎖が重合Aβと複合体を形成し、ミクログリア貪食によるアミロイド斑除去を阻害していると考えられる。申請者らは脳内アミロイド斑に蓄積するヘパラン硫酸糖鎖を報告しその糖鎖がリコンビナントの細胞外スルファターゼSulf-2により分解され得ることを報告した。本研究は、ミクログリア細胞特異的にSulf-2を発現するトランスジェニックマウスを作製し、アルツハイマー病モデルマウス脳においてAβに結合するヘパラン硫酸糖鎖を分解し、ミクログリア細胞貪食によるAβ除去を促進させることを目的とする。活性型Sulf-2または不活性型Sulf-2と緑色蛍光タンパク質GFPを同時にミクログリアで発現させるレンチウィルス発現システムを用いて、これらのSulf-2を恒常的に発現するマウスBV2ミクログリア細胞株を作製した。当該細胞およびアルツハイマー病モデルマウス脳凍結切片を用いた実験から、活性型Sulf-2発現がex vivoでアミロイド斑Aβ貪食作用を促進することが明らかとなった。現在、ミクログリアでSulf-2を発現するアルツハイマー病モデルtriple Tgマウスを作製している。In vivoにおけるSulf-2のAβ貪食作用への影響が明らかになると期待される。
2: おおむね順調に進展している
昨年度の達成度は当初の予定よりやや遅れていたが、今年度は力価の高いレンチウィルスの作製が順調に行きSulf-2発現ミクログリア細胞株が安定して得られるシステムを構築出来たので予定通り進捗した。これらの細胞を使用したex vivoでの貪食能測定方法も確立できた。ミクログリアで細胞特異的にSulf-2を発現するトランスジェニックマウスの作製を行った結果、３,４種のマウス系統を得ることができた。このうちの１系統に関してはLyzs-Creマウスとの交配の結果、コンディショナルにSulf-2を発現するダブルトランスジェニック系統を得ることに成功した。現在、当該マウスとアルツハイマーモデルAPP-Tgとの交配によりトリプルトランスジェニックマウスを作製している。In vivo実験の達成度は順調である。今後の研究が予定通り進捗すると期待される。
昨年度及び今年度に得られた結果を基にして、ex vivo 実験を引き続き行う。BV2細胞株の他、MG5マウスミクログリア細胞株およびSulf-2コンディショナルトランスジェニックマウスLyzs-Cre/CAG-flox-STOP-flox-Sulf2-Tgより調製する初代ミクログリア細胞に対しても同様にex vivoの実験を行う。In vivo 分子病態解析に必要なtriple Tgマウスの交配を引き続き行い必要な匹数を確保する。アルツハイマー病理変化を観察するには加齢育成が必要なので実施する。沈着Aβと共局在し蓄積するヘパラン硫酸多硫酸化ドメインの検出がtriple Tgマウス脳で消失するか否か、ミクログリア細胞の貪食能が促進されるか否かを組織染色により明らかにする。本研究においてアルツハイマー病モデルマウスAPP-Tg，Sulf2コンディショナルトランスジェニックマウスCAG-flox-STOP-flox-Sulf2-Tgおよびミクログリア特異的Creリコンビナーゼ発現マウスLyzs-Creの交配育成が必要となる。アルツハイマー病様病理変化が認められる12ヶ月齢以上のマウス加齢育成が必要となる。実験動物購入および動物系統の維持に費やす費用に当該研究費を使用する。マウスの管理および維持のため、非常勤実験補助員が一名の人件費・謝金を計上する必要がある。引き続き消耗品として病変解析各種抗体、アミロイドβペプチド、アミロイドβ測定用ELISAキット、レンチウィルス作製、精製キットなどの試薬、細胞培養用の培地および血清を購入する。
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