| 研究課題/領域番号 |
24590350
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 豊橋技術科学大学 |
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研究代表者 |
沼野 利佳 豊橋技術科学大学, エレクトロニクス先端融合研究所, テニュアトラック准教授 (30462716)
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| 研究分担者 |
中尾 和貴 東京大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (20217657)
河野 剛士 豊橋技術科学大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (70452216)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | 概日リズム / SCNslice / VLSプローブチップ |
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| 研究概要 |
本研究で使用する遺伝子組み換えマウスを用いた研究は、特定の微生物感染をしていないことが証明されたSPF実験空間において飼育されたマウスを用いて行う。そのために、まず、マウス飼育施設や また、マウスの脳スライスをもちいた研究のために、サンプルを用意する施設・設備・体制を立ち上げた。
哺乳類の概日リズムの中枢である視交叉上核(SCN)で、リズムが遺伝子レベルでどのように発振されているかを調べるために、リズム制御において重要な役割を担うPeriod1遺伝子(Per1)の発現を指標にして、組織の時計機能をリアルタイムで１細胞レベル測定をする。そのため、Per1発現制御領域に連結させたリポーターの緑蛍光GFPを確認できるPer1::GFP組み換えマウスを確立した。このマウスのSCN スライスや他の末梢組織を培養しながら、共焦点や２光子顕微鏡で観察する実験系を確立した。培養スライス中において、細胞のPer1の発現振動は部位により位相は少しずつずれていることがわかった。 ひきつづき、より長期観察に適切な培養方法を工夫している。
また、SCNの神経細胞では、発火スパイク頻度が昼高く、夜低い、24時間周期の振動を示すが、この発火スパイク頻度リズムをマルチポジションで、感度良く測定するために、Vapor-liquid-solid(VLS)法で作成された微小刺入型マルチ電極プローブをアレイ状に並べたセンサーチップを用いる。直径数nmの微小プローブのため、１細胞の神経活動計測かでき、さらに、同じ電極プローブで、神経電気刺激を行うことができる。また、豊橋プローブ先端に、先端の形状を尖端化するタイプのほかに、より強力な電気刺激を行う目的の構造体を付加したものもあり、先端近くの数個の神経細胞の細胞外電位の総和をとりながら、局所的な電気刺激を試みたが、いまだ、長時間で観察できていない。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初の予定通り、SPF環境飼育のPer1::GFP組み換えマウスのSCN スライスや他の末梢組織を培養しながら、慨日リズムの変化を時計遺伝子の発現変化・GFPシグナルの変化として、共焦点や２光子顕微鏡で観察している。しかし、現在、２～３日にわたる長期培養観察には成功していないため、適切な培養方法を模索している。
また、豊橋技術科学大学の独自開発の、Vapor-liquid-solid(VLS)法で作成されたさまざまな微小刺入型マルチ電極プローブチップで、神経活動計測・神経電気刺激を脳スライスに対して行っている。電極プローブはアレイ状に複数本存在するが、全プローブからデータが取得できることは少なく、その成功率の上昇にサンプルの培養方法や、電極の形状について異なる方法を試行している。また、現在は、数個の細胞からスパイクを測定する細胞外電極をもちいて実験しているが、細胞内電極による１細胞からの信号取得向けても異なる方法を試行している。
以上のことから、おおむね順調に進行している。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後の推進方策については、組み換えマウスのSCN スライスや他の末梢組織を培養しながら、慨日リズムの変化を２～３日にわたる長期培養観察を行い、さらに1細胞レベルでの観察を試みる。2光子顕微鏡による厚いスライスの観察により、直径1mmのSCNのできだけ全体について観察することを行う。このためには、培養や観察方法、機器側の改善、また、解析データの効率的な処理方法など多くの課題に取り組む必要がある。
また、微小刺入型マルチ電極プローブチップで神経活動計測・神経電気刺激を脳スライスに対して行う実験は、電極プローブからのデータが取得の成功率を上げるために、培養や観察方法、機器側の改善を行う。サンプルの電極プローブとの接着や、電極プローブのパッケージングなどの形態、長期培養に耐えうる防水性などの工夫などが必要である。また、１細胞からの信号取得向けてや、上記のイメージングとの合体による、遺伝子発現と電気生理学的な変化の同時観察の実験系に融合させる。刺激は、電極プローブによる電気刺激を行い、遺伝子発現と電気生理学的な変化の相関関係や、連動の仕組み、タイムラグなどがどのように起こるかを調べる。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
研究代表者の直接経費は、650,000円。その内訳は、物品費として、電気生理実験に使用するスティムレーターや細胞や組織の培養にかかる消耗品購入に350,000円を使用を予定している。
旅費として、 研究打ち合わせや学会参加費に200,000円を使用予定。人件費・謝礼金として、0円を使用予定。その他として、動物の維持管理費200,000円を使用予定。
間接経費として、270,000円を計上する。
また、外部分担者への分担金として、250,000円を計上する。分担者は、電極プローブの製造・改善、組み換えマウスの作成・系統保存を行う。
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