| 研究課題/領域番号 |
24590358
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| 研究機関 | 獨協医科大学 |
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研究代表者 |
杉本 博之 獨協医科大学, 医学部, 教授 (00235897)
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| 研究分担者 |
堀端 康博 獨協医科大学, 医学部, 助教 (80392116) [辞退]
佐藤 元康 獨協医科大学, 医学部, 助教 (20418891)
青山 智英子 獨協医科大学, 医学部, 助教 (90420778)
安戸 博美 獨協医科大学, 医学部, 助教 (10704885)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | シチジリルトランスフェラーゼ / ホスファチジルエタノールアミン / NF-Y / HMG-CoAレダクターゼ / コレステロール / Yin Yang1 |
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| 研究実績の概要 |
本研究の目的は、細胞膜を構成する主なリン脂質であるホスファチジルエタノールアミン(PE)合成の律速酵素CTP:ホスホエタノールアミン・シチジリルトランスフェラーゼ(ET)の活性調節機構に注目し、ETの活性制御機構を転写および翻訳後レベルで解明することである。同時にコレステロール合成の律速酵素HMG-CoAレダクターゼの転写調節機構にも注目し、PEとコレステロールの合成がどのような機構により協調して細胞膜脂質組成の恒常性が維持されているのかも解明する。この過程で、ETのプロモーターにはSterol regulatory element (SRE)を認めないが、25-ヒドロキシコレステロール(25-OHC)を培養細胞に添加するとETの転写および酵素活性が抑制されることを見出し報告した。
平成24年度は、マウスETプロモーターのレポーター解析から、-57/-37領域に25-OHCにより転写抑制を受ける領域を見いだした。-57/-37 領域のGel-shift法から、本領域内に結合する転写因子を認め、Yeast one hybrid法により、本領域に結合する転写因子NF-YとYin Yang1 (YY1)を同定することができた。
平成25年度は、NF-YやYY1に対するsi-RNAで細胞を前処理したところ、内因性NF-YやYY1の低下によりETの基本転写レベルが低下し、25-OHCによるET転写抑制効果の減弱が認められた。
平成26年度にはこの機構を分子レベルで明らかにするためChIP Assay法を行った。この結果、25-OHCを添加するとETプロモーター上でNF-YとRNA polymerase IIの結合が低下することで、ETの転写も低下することが明らかになった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
細胞膜を構成する主な脂質には、ホスファチジルコリン(PC)、ホスファチジルエタノールアミン(PE)およびコレステロールが知られており、それら脂質の細胞膜における組成はほぼ一定に保たれている。本研究の目的はPE合成の律速酵素CTP:ホスホエタノールアミン・シチジリルトランスフェラーゼ(ET)の活性調節機構に注目し、ETの活性制御機構を転写および翻訳後レベルで解明することである。同時にコレステロール合成の律速酵素 HMG-CoAレダクターゼの活性調節機構にも注目し、PEとコレステロールの合成がどのような機構により協調して細胞膜脂質組成の恒常性が維持されているのか、その新たな調節機構を分子のレベルで見出す事である。
これまでの研究により、NF-YとYin Yang 1 (YY1)がETのプロモーターに結合し25-OHC添加によるETの転写抑制機構に関わることが明らかになった。NF-YもYY1もET転写の促進性転写因子として作用していることがレポーター解析から確認されたが、25-OHC添加によりその促進作用が低下することも明らかになった。
HMG-CoAレダクターゼのプロモーターにも注目し転写調節機構を解析したところ、HMG-CoAレダクターゼのプロモーターにもNF-Yが結合し、25-OHCに応答した転写抑制に関わることが明らかになった。
ETおよびHMG-CoAレダクターゼのプロモーターのChIP解析を行い、25-OHCはこれら酵素のプロモーターに結合するNF-YとRNA polymerase IIとの結合を抑制することで、これら酵素の転写を抑制することが明らかになった。
以上からおおむね順調に進展していると判断される。
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| 今後の研究の推進方策 |
本研究の目的はホスファチジルエタノールアミン(PE)ばかりでなくコレステロール合成の律速酵素 HMG-CoAレダクターゼの活性調節機構にも注目し、PEとコレステロールの合成がどのような機構により協調して行われ細胞膜脂質組成の恒常性が維持されているのか、その新たな調節機構を分子のレベルで見出す事である。これまでの研究から、これら酵素の転写調節を担う転写因子としてNF-YとYY1を得ることができた。マウスHMG-CoAレダクターゼのプロモーター領域にはSRE(-111/-104)が存在するが、このプロモーターのレポーター解析から、-30/-10領域にも25-OHCにより抑制性の転写制御を受ける領域の存在が示唆された。その領域にはNF-Yの結合コンセンサスが認められ、Gel-shift法によりNF-Yの結合も確認できた。-116/-111前後の領域にはYY1の結合が認められた。このことはNF-YとYY1によりETの転写制御と同じような機構によりHMG-CoAレダクターゼも転写制御を受けていることが示唆される。
ETおよびHMG-CoAレダクターゼのプロモーターのChIP解析を行い、25-OHCはこれら酵素のプロモーターに結合するNF-YとRNA polymerase IIとの結合を抑制することで、これら酵素の転写を抑制することが明らかになった。NF-Yと25-OHCがどのように相互作用することで転写抑制に関わるのか、さらに解明を進める。
細胞内にはコレステロールから25-OHCを産生するコレステロール25-ヒドロキシラーゼが存在する。細胞内におけるオキシステロール合成調節機構にも注目する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
細胞培養時にFBS濃度を変化させ細胞内オキシステロールの組成変化や定量を行う予定であるが、そのために必要な器機であるLC-MS/MSの購入が平成27年度になったため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
LC-MS/MSに利用するカラムやスタンダード脂質などの消耗品を購入する。
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