| 研究課題/領域番号 |
24590388
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 熊本大学 |
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研究代表者 |
桑原 一彦 熊本大学, 大学院生命科学研究部, 准教授 (10263469)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | 非遺伝性散発性乳癌 / マウスモデル / DNA傷害 / mRNA核外輸送 |
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| 研究概要 |
１）正常乳腺上皮細胞におけるＧＡＮＰ発現上昇の意義
ＧＡＮＰはリンパ組織の胚中心で高い発現を認め、その理由として転写共役型遺伝子傷害を保護するためであることを最近見出した。乳腺上皮でＧＡＮＰの発現が高い理由としてエストロゲンの関与を考えたが、ヒト乳癌細胞株ＭＣＦ７を用いた解析ではエストロゲン刺激前後でＧＡＮＰの発現に変化を認めず、他の外的刺激（紫外線、放射線など）でもＧＡＮＰの発現に変化は見られなかった。乳腺上皮においてもＧＡＮＰの発現が遺伝子傷害の抑制に関与する可能性を考え、ＭＣＦ７をエストロゲンで刺激後、コメットアッセイを行った。ＧＡＮＰをノックダウンしたＭＣＦ７はコントロールの細胞と比較してエストロゲンによる遺伝子傷害が増加し、逆にＧＡＮＰを過剰発現させた細胞はコントロール細胞に比べて遺伝子傷害が減少した。
２）乳腺上皮細胞の増殖、分化に及ぼす「転写共役型ＤＮＡ傷害」の影響
正常マウスと乳腺特異的ＧＡＮＰ欠損マウスを妊娠させて乳腺組織を摘出し、組織学的解析を行った。１）の結果から妊娠時のエストロゲンによる遺伝子傷害が乳腺組織に影響を与える可能性が考えられた。妊娠後期、出産直後、出産後1週間、出産後２週間で乳腺を摘出し、ヘマトキリン－エオシン染色による組織解析を行った。その結果、乳腺特異的ＧＡＮＰ欠損マウスでは乳腺構造の発達障害が起こることが判明した。
３）ＧＡＮＰが制御する乳癌発症に関与する分子の確定
これまでにＧＡＮＰ結合分子の同定を行ったが、現時点でＤＮＡ修復、細胞周期、ゲノム安定性などに関与する分子は同定されていない。そこで、ＭＣＦ７を用いたｇａｎｐノックダウンによりＧＡＮＰの発現を低下させ、核外輸送が障害されるｍＲＮＡを網羅的遺伝子発現プロファイルにより解析した。数十種の候補が得られているが、実際にｍＲＮＡ核外輸送が障害されているかに関しては平成２５年度に解析する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
１）正常乳腺上皮細胞におけるＧＡＮＰ発現上昇の意義
交付申請書では乳腺組織でＧＡＮＰが発現上昇する外的刺激を明らかにすることを記載したが、ＧＡＮＰの発現を誘導する外的刺激は明らかにできていない。しかし、免疫系の解析による情報からＧＡＮＰの発現が上昇する意義はＤＮＡ傷害を抑制することであり、実際ＭＣＦ７を用いた解析でこの点を明らかにすることができた。乳腺の発達にはエストロゲンが重要であり、このホルモンはＤＮＡ傷害を誘導することが種々報告されている。我々の結果は細胞株を用いた解析ではあるが、乳腺上皮でＧＡＮＰの発現が上昇する意義はエストロゲンが誘導する遺伝子傷害が過剰に起こらないようにしているためと思われる。
２）乳腺上皮細胞の増殖、分化に及ぼす「転写共役型ＤＮＡ傷害」の影響
正常マウスと乳腺特異的ＧＡＮＰ欠損マウスの乳腺組織の解析からエストロゲンによる遺伝子傷害がどのように乳腺組織に影響を与えるかを解析した。出産直後、出産後1週間、出産後２週間で乳腺を摘出し、ヘマトキリン－エオシン染色による組織解析を行った。その結果、乳腺特異的ＧＡＮＰ欠損マウスでは乳腺構造の発達障害が起こることが判明し、この異常は以前報告された乳腺特異的Brca1欠損マウスの表現型と類似していた。
３）ＧＡＮＰが制御する乳癌発症に関与する分子（群）の確定
交付申請書には遺伝子発現プロファイル解析のために、ノックダウンに加えて過剰発現株の作製を記載した。これまでの解析結果からＧＡＮＰのヒストンアセチル化ドメインの乳癌発症に関与するかは明確になっていないため、２４年度はノックダウン細胞を使った解析のみを行うことに変更した。
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| 今後の研究の推進方策 |
２）乳腺上皮細胞の増殖、分化に及ぼす「転写共役型ＤＮＡ傷害」の影響（平成２４年度の続き）
ＧＡＮＰは出芽酵母ＴＲＥＸ２複合体の一員ＳＡＣ３の哺乳動物相同分子だが、ＴＲＥＸ２の他の構成分子ＴＨＰ１の哺乳動物相同分子ＰＣＩＤ２の機能も我々は明らかにしている。ＰＣＩＤ２はＧＡＮＰと異なりＭＡＤ２ ｍＲＮＡの核外輸送に関与し、B細胞特異的ＰＣＩＤ２欠損マウスでは高度なＢ細胞分化障害が起こる。この表現型にも「転写共役型ＤＮＡ傷害」が関与することが考えられる。そこでＷａｐ－ＣｒeマウスとＰＣＩＤ２－ｆｌｏｘマウスを交配して乳腺特異的ＰＣＩＤ２欠損マウスを作成し、乳腺特異的ＧＡＮＰ欠損マウス同様妊娠させたマウスから乳腺組織を摘出し、組織学的解析を行う。
３）ＧＡＮＰが制御する乳癌発症に関与する分子の確定（平成２４年度の続き）
平成２４年度に行ったマイクロアレイの結果の解析を詳細に行い、候補遺伝子の発現が確かに変化することをＰＣＲで確認する。候補遺伝子を、ＤＮＡ修復、細胞周期、ゲノム安定性に関与するか、これまでに報告されている乳癌感受性遺伝子に含まれるか、などの点から絞り込む。
４）ヒト乳癌臨床検体におけるＧＡＮＰタンパク発現低下の原因の探索
我々はこれまでに９２例の非遺伝性乳癌の検体を抗ＧＡＮＰ抗体により免疫染色し、リンパ節転移を伴う悪性度の高い癌は正常乳腺や上皮内癌と比較してＧＡＮＰの発現が著しく低いことを見出した。最初にｇａｎｐ ｍＲＮＡの発現レベルが低下しているのか、をリアルタイムＰＣＲで解析する。臨床検体でＧＡＮＰ同様にｇａｎｐ ｍＲＮＡも発現と悪性度が逆相関する場合は、ヒトｇａｎｐプロモーター領域のメチル化の有無などの解析を行う。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
平成２５年度の研究費の総額は１３０万円で、その内訳として物品費８０万円、旅費３０万円、その他２０万円を予定している。物品費としては、培養用プラスチック製品（フラスコ、遠心用チューブ、培養用ディッシュなど）、リアルタイムＰＣＲ用試薬、分子生物学的実験のための種々の試薬（ＰＣＲ用試薬、シークエンス用試薬、ライゲーションキットなど）に６０万円を充てる予定で、乳腺特異的ＰＣＩＤ２欠損マウスの作成及び解析を行うため、熊本大学動物センターにおける動物飼育費用にも２０万円は使用する予定である。得られた成果発表の場として日本がん分子標的治療学会（京都）、日本癌学会（横浜）、日本免疫学会（千葉）での発表を予定しており、旅費はそれらの参加費用に充てる。その他の経費はサンプルの運搬費、文書等の連絡費などにあてる予定である。
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