研究課題
基盤研究(C)
癌の発生・進展に関与する細胞内シグナル伝達の制御破綻は、主にキナーゼの活性亢進に起因するため、キナーゼを標的とした分子標的治療薬の開発・臨床応用が進んでいる。現在、gefitinib (EGFR阻害薬)やimatinib (BCR-ABL阻害薬)などキナーゼを標的とした分子標的治療薬が使用されているが、低い奏功率、副作用や耐性細胞の出現など克服すべき問題も多い。この一因は、癌細胞では複数のキナーゼ活性化によるシグナル伝達経路の複雑かつ異常なクロストークが生じていることにある。本研究では、現在問題となっている分子標的治療薬に対する耐性メカニズムを解明し、耐性解除のために有効なキナーゼ阻害薬の選定とリプロファイリングを目的とする。具体的には、ヒト脳腫瘍細胞株を用いて各種キナーゼ阻害薬に対する耐性細胞株を樹立後、各細胞株で活性化亢進しているキナーゼおよびその下流シグナル伝達経路を同定、薬剤耐性を解除するために最も効率の良いキナーゼ阻害薬を洗い出す。当該年度は、下記①～②を行った。① ヒト脳腫瘍の分子標的治療薬耐性獲得に重要なキナーゼの同定樹立した３種類のヒト脳腫瘍薬剤耐性細胞株を用いて、Y／STキナーゼを含めた「リン酸化アレイ」を実施し、各細胞株間で普遍的あるいは特異的に活性化しているキナーゼを同定した。活性化が認められたキナーゼに対してはイムノブロッティングを行い、その信頼性を検証した。同時に、cDNAマイクロアレイ解析も実施し、キナーゼの活性化が発現量あるいは活性化に依存するのかを検討した。また、細胞株で得られた結果が、ヒト脳腫瘍組織においても再現されるかを検討した。② キナーゼ阻害薬の抑制プロファイル構築上記①で同定された活性化キナーゼに対して、PyMOLソフトウェアを用いてin silicoでの「キナーゼ阻害薬とATP結合領域の構造解析」を行い、結合可能性を検討した。
2: おおむね順調に進展している
当該研究では、癌の発生・進展、特に現在、実臨床で大きな問題となっている癌の分子標的治療薬に対する耐性獲得メカニズムを解明し、耐性解除するために有効なキナーゼ阻害薬の選定とリプロファイリングを目的としている。平成２４年度は、脳腫瘍において発現量および活性化が亢進している３種類のチロシンキナーゼに対する阻害薬を、ヒト脳腫瘍培養細胞株に長期間処理することにより各種耐性細胞株を樹立、「リン酸化アレイ」「イムノブロッティング」「定量的RT-PCR」「cDNAマイクロアレイ」を駆使することにより、各細胞株で活性化亢進しているキナーゼおよびその下流シグナル伝達経路を同定した。また、ヒト脳腫瘍組織を用いて、結果の普遍性も確認済みである。現在、薬剤耐性を解除するために最も効率の良いキナーゼ阻害薬を洗い出している過程であり、そのために平成２５年度に研究計画をしている、キナーゼの活性化をモニタリングする「FRETバイオセンサー」の作製にも着手している。このように、現在、研究は順調に進展している。
平成２５年度は、下記①～③を実施予定である。① キナーゼ活性をモニタリングする新規バイセンサーの作製：平成２４年度の研究成果により同定された各種キナーゼに対して、その活性をモニタリングできる「FRETバイオセンサー」を作製する。研究代表者らはこれまで、既にBCR-ABLキナーゼの活性化状態を評価可能なPicklesプローブの作製に成功しており、このノウハウを応用して順次プローブを作製する。② FRETバイオセンサーを用いたキナーゼ阻害薬の有効性評価：①で作製したFRETバイオセンサーを適用し、実際に生きた癌細胞内においてその阻害薬が標的キナーゼの活性を抑制するか否かを測定・評価する。具体的には、まず、樹立した各種キナーゼ阻害薬耐性ヒト脳腫瘍細胞株に対して、作製したバイオセンサーを遺伝子導入し、蛍光顕微鏡システムを用いてCFP、YFP、FRETの各蛍光強度からキナーゼ活性を確認する。その後、各種薬剤処理を施し、24時間経過後に再度イメージングを実施、各蛍光強度から薬剤の有効性を計測・評価する。③ 細胞および個体レベルでの阻害薬の有効性検証：上記②により、FRETバイオセンサーにより細胞内での薬剤の有効性が確認された場合には、実際に、細胞およびマウス個体レベルにおいて抗腫瘍効果を検討する。この検証には、現在日常的に行っている細胞増殖能、運動・浸潤能、マウスゼノグラフト、病理学的検索等を実施する。
該当なし
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