| 研究課題/領域番号 |
24590495
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| 研究機関 | 福岡大学 |
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研究代表者 |
鍋島 一樹 福岡大学, 医学部, 教授 (40189189)
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| 研究分担者 |
古賀 佳織 福岡大学, 医学部, 助教 (40572433)
青木 光希子 福岡大学, 医学部, 助教 (80469379)
濱崎 慎 福岡大学, 医学部, 講師 (90412600)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 簇出型浸潤 / miRNA / 肺癌 / Micropapillary pattern / tumor budding / sprouting |
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| 研究実績の概要 |
この研究の目的は癌組織標本の簇出型浸潤部と非簇出型浸潤部より、microdissection (MD)にてRNAを抽出し、miRNA arrayを施行して簇出型浸潤関連miRNAを解析することである。肺癌における簇出型浸潤例である微小乳頭状構造(MPP)を示す腺癌の解析と、同様に簇出型浸潤例である大腸癌先進部におけるtumor budding/sprouting (TB)における解析を行っている。
後者に関しては、すでに、高TB群では浸潤先端部において有意にc-METの発現とリン酸化が亢進して、短い予後とも相関し、MPP陽性肺腺癌におけるc-METの発現とリン酸化の亢進と同様の現象が生じており、簇出型浸潤部においては共通してHGF-c-MET系を介した機構が作用していることが推定された。
前者に関して26年度には、MPPを示す浸潤癌vs MPPの無い非浸潤癌(Array①)、MPPを示す浸潤癌vs MPPの無い浸潤癌(Array②)、MPPの無い浸潤癌vs MPPの無い非浸潤癌(Array③)の組み合わせで、それぞれ2症例のFFPEよりMDを用いてtotal RNAを抽出し、microarray解析を行った。Microarray dataの標準化および解析はAgilent Technologies社のGeneSpringを使用。3回のマイクロアレイ全てで確認された成熟型microRNAは261個だった。得られた解析結果からHeat Map図を作成し、クラスターに分類。MPP 関連miRNA を解析する目的で、Array①で有意な変動があり、Array③で変動のないmicroRNAを抽出。絞り込んだ10個のmicroRNAをreal time RT-PCRにて確認した。一方、Array②で増減いずれかの変動があり、かつArray③で変動のないmicroRNA6個も抽出し、real time RT-PCRで確認した。内在性コントロールはRNU6Bを使用した。
抽出したmicroRNAについて、miRWalkおよびTargetScanを用いて、予測ターゲットmRNAの探索を行い、さらにその予想されるターゲットmRNAのpathway, Gene Ontology, Annotation等の解析をDAVIDにて行っている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
前年度の共同機器センターにおけるmicrodissection機器の更新により、すでに行っていたmicrodissectionからRNA抽出およびmiRNA arrayまでの過程の条件設定を再度行わねばならなかったこと、さらに度重なる新規導入機器の不具合によってmicrodissectionのステップで遅滞が生じた。3回のマイクロアレイで得られた261個のmicroRNAのVenn Diagram解析およびHeat Map図作成とクラスターへの分類においても予想以上に時間を要し、遅れにつながったと考えている。しかしすでに解析からMPP関連microRNA候補を抽出し、その発現確認を行っているので、目的とする簇出型浸潤関連miRNAを絞込むことができるのではないかと期待している。一方で、臨床病理学的に、大腸癌でも肺腺癌でも、簇出型浸潤においては、c-METの発現とリン酸化の亢進が関与することを確認ができた意味は大きく、上記の簇出型浸潤関連miRNAおよびtarget mRNA, pathwaysの同定、絞り込みを大いに助けると考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
上記のごとく、すでに解析からMPP関連microRNA候補を抽出し、その発現確認を行っているので、各候補microRNAについて、MPPを示す浸潤癌およびMPPの無い浸潤癌などの症例（FFPE標本）からのtotal RNAを用いて、Real-time RT-PCR法にて実際に有意な発現の差が得られるのか検討を進める。MPP関連microRNAが同定されたならば、Locked RNA probeを用いたFISH法にて、その組織上での発現分布等に関して形態とあわせて確認および解析を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
Microarray解析のVenn Diagram, Volcano PlotによるmiRNAの抽出とクラスター化によるMPP関連miRNAの絞り込み、miRWalkによるそれらのtarget mRNAの抽出と絞込みを並行して行い、その腫瘍組織での発現解析を行っている。MPP関連microRNAが同定されたならば、Locked RNA probeを用いたFISH法にて、その組織上での形態とあわせた発現分布等の確認および解析を行いたく、FISH法の為の予算を残し、来年度までの研究延長申請をする次第である。
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| 次年度使用額の使用計画 |
腫瘍組織での候補miRNAの発現解析とLocked RNA probeを用いたFISH法に用いる。
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