| 研究課題/領域番号 |
24590563
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 国立感染症研究所 |
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研究代表者 |
鈴木 亮介 国立感染症研究所, ウイルス第二部, 主任研究官 (50342902)
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| 研究分担者 |
黒田 俊一 名古屋大学, 生命農学研究科, 教授 (60263406)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | B型肝炎ウイルス / 細胞表面蛋白質 |
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| 研究概要 |
組換え酵母を用いてB型肝炎ウイルス(HBV)のL蛋白質を発現させ、組換えHBV粒子を精製したHepG2細胞、Huh7細胞、FLC4細胞、FLC5細胞、Alexander細胞等のヒト肝臓由来細胞やマウス肝臓由来細胞、さらにヒトの肝臓以外の組織由来の細胞株等について、酵母発現組換えHBV粒子の結合能をフローサイトメーターを用いて定量的に解析した。その中でウイルスが最も良く結合する細胞をトリプシン処理すると、ウイルス粒子の結合能が低下した事から、蛋白質を介したウイルス粒子の結合が示唆された。そこでウイルスが最も良く結合する細胞とほとんど結合を示さない細胞について、異なる安定同位体標識アミノ酸含有培地で培養した後に、細胞表面蛋白質をビオチン標識し、精製を行った。これを質量分析法を用いて発現レベルの異なる蛋白質を同定した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
今年度は組換え酵母発現HBV粒子を発現、精製し、その粒子を用いて培養細胞表面への結合を定量的に解析するアッセイ系を確立し、良く結合する細胞とほとんど結合を示さない細胞の存在を明らかにする事が出来た。さらにそれらの細胞表面上の発現レベルの異なる蛋白質を多数同定した。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は同定された分子のsiRNAをHBV粒子が結合する細胞へ導入し、HBV粒子の結合に及ぼす影響を解析し、結合に重要な宿主因子を同定する。
また一方で、上記の方法ではウイルス粒子結合蛋白質の同定が困難な場合に備え、別の方法を用いて研究を推進する。HBV粒子が最も良く結合する培養細胞よりmRNAを抽出し、レトロウイルスベースのcDNAライブラリーを構築する。レトロウイルスcDNAライブラリーを、HBV粒子が結合しない細胞に導入し、HBV粒子結合能を示す細胞を選別し、ライブラリー由来の遺伝子をクローニングする事により、細胞表面分子の同定を試みる。
いずれかの方法によりHBV粒子の結合に重要な蛋白質を同定すれば、その結合責任領域を明らかにする為に、様々な欠損変異体発現プラスミドを構築し、解析を行なう。また培養細胞のHBV感染実験系において、同定された分子の関与を明らかにする。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
物品（ウシ胎児血清、培養液、各種抗体、PCR 試薬、ELISA 関連試薬、電気泳動関係、siRNA、トランスフェクション試薬）、プラスチック器具類（細胞培養容器、ピペット類、手袋等）、国内旅費、海外旅費、人件費、謝金、その他
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