| 研究課題/領域番号 |
24590735
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| 研究機関 | 関西医科大学 |
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研究代表者 |
松村 伸治 関西医科大学, 医学部, 講師 (70276393)
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| 研究分担者 |
伊藤 誠二 関西医科大学, 医学部, 教授 (80201325)
西田 和彦 関西医科大学, 医学部, 助教 (80448026)
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| キーワード | 多光子励起顕微鏡 / in vivo標本 / 脊髄 / カルシウム / イメージング / in utero遺伝子導入法 / 痛み / 神経障害性疼痛 |
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| 研究概要 |
神経障害性疼痛の発生機序に大きな役割を担うと考えられる脊髄後角内の神経可塑性を伴う感覚情報伝達系の機能異常に焦点を絞り、in vivo脊髄標本を用いたバイオイメージング法により体性感覚情報伝達神経回路網の構造とその活動を経時的に同時に可視化している。興奮性と抑制性介在ニューロンを選択的にイメージングして刺激－応答地図を作成し、その地図で触覚・圧・温・冷と痛覚がどう違うかを解析、さらに、疼痛モデルにおいて疼痛維持の可塑性形成に関与するニューロンの形態学的変化と機能的変化の連関を解明できれば、触覚のような非侵害刺激を痛覚と誤認してしまうアロディニアがなぜ生じるかの理解の糸口となる。In utero遺伝子導入法を用いて確立した、蛍光カルシウムプローブのCameleonファミリータンパク質を脊髄後角ニューロン特異的に発現したマウスを作製し、そのマウスの多光子励起顕微鏡を用いたin vivo観察により疼痛情報伝達の場である膠様質層ニューロンの痛み刺激、接触刺激、熱刺激に対する応答を記録し、脊髄後角内の分布を明らかにしつつ有る。
Thy1プロモーターを用いてニューロン特異的に蛍光タンパク質であるYFPを発現するトランスジェニックマウスを用いて、脊髄後角膠様質内のニューロンの神経突起の形態的経時変化追跡に成功した。健常マウス脊髄ではそのシナプスマーカーであるPSD95と共局在するYFP蛍光を有する斑点の数は観察中変化しなかったが、急性炎症性疼痛を引き起こす物質を後肢に投与したマウスでは斑点の数が増加し、それはNMDA受容体阻害剤やAMPA/kainate受容体阻害剤でその効果はブロックされた。電気生理学的に神経活動の促進が報告されていたが、形態学的にも変化が起こることをリアルタイムに明らかにした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
1. 脊髄後角ニューロンの同定と感覚刺激－応答地図の作成(松村、伊藤、西田) 1) 標的ニューロン特異的に蛍光タンパク質を発現するマウスの作製（西田） ニューロン特異的なプロモーター遺伝子を用いて細胞特異的に発現する蛍光タンパク遺伝子を脊髄にin utero遺伝子導入法により導入し、脊髄腰膨大部後角ニューロン特異的に蛍光タンパク発現に成功している。
2) in vivo標本作製法の確立（松村） 呼吸・心拍振動ノイズをイメージングに耐えられる程度に抑えるために、動物麻酔法、椎弓削除法、脊椎固定法の条件検討を行い、皮膚つまみ刺激でカルシウム濃度増大が惹起されるニューロン観察法を確立している。
3)脊髄腰膨大部後角ニューロン回路の３次元観察（松村、伊藤） 刺激－応答地図を作成するためにコレラトキシンBに蛍光プローブを重合させたもので末梢からのトレースによる支配領域の可視化に成功した。
4)脊髄ニューロンからの刺激応答反応の記録（松村、西田） 脊髄ニューロンの刺激応答反応を記録するために、in vivo標本に対する多光子励起顕微鏡を用いたカルシウムイメージング法を確立した。
2. 炎症性疼痛モデル動物脊髄のニューロンの形態的および機能的変化の経時的追跡（松村、伊藤、西田） Thy1-YFPトランスジェニックマウスを用いたin vivo標本脊髄後角ニューロンの多光子励起顕微鏡による形態観察により、CFA投与によるL5脊髄ニューロンの経時的形態変化の追跡に成功した。ニューロンからの神経突起にspine様構造の増加が投与後60分から現れる事が明らかとなった。また、それらの構造のほかに斑点状のシナプスマーカーと共局在する構造が増大する。個々の個体における斑点の数はばらつきが有り、リアルタイムに同一個体で追跡する事によりその変化を初めてとらえる事が出来た。
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| 今後の研究の推進方策 |
引き続き、in utero導入法の利点を充分に活用し、発現プロモーターやGCaMP6などの新規に報告されたカルシウムプローブタンパクをうまく組み合わせ、ベクターの設計変更を施し研究遂行により適切なマウスを作製する。そのために必要なマウス、試薬類を購入する。マウスの飼育に必要な費用を執行する。脊髄の呼吸や心拍による振動、経時的な膨潤等を押さえるために必要な装置部品を設計し補充する。灌流系を構築し、長時間記録が可能にするための装置部品も設計・作製する。生理学的な実験や薬理学的な実験に必要な試薬類、実験器具を購入する。３次元立体画像の経時的カルシウムイメージングのデータは非常に膨大となる。貴重なデータを保全し、効率的に解析をするために本研究専用に記憶媒体をはじめとしたハードウエアおよびソフトウエアを必要に応じて購入する。今までの研究成果を発表するために参加する国内外の学会参加の旅費を執行する。また、論文投稿に必要な諸経費を執行する。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
研究の進捗状況はおおむね順調であるが、長期間安定記録のための、マウスin vivo標本作製技術は一般に普及していないオリジナルのもので、その標本を固定する固定器やマニュピレーターは既製品では対応出来ないので、特注する必要が有り、その設計に予想以上の時間を必要としたので年度内執行に間に合わなかった。
in vivo標本固定器の特注するための設計図が出来次第発注し、既製品では対応出来ないオリジナルの実験系を組んで研究を遂行する。
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