次世代シークエンサーによるＨＣＶゲノム解析と薬剤耐性機構の解明

2012 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 24590964
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 研究機関: 山梨大学
• 研究代表者: 坂本 穣 山梨大学, 医学工学総合研究部, 准教授 (60324191)
• 研究期間 (年度): 2012-04-01 – 2015-03-31
• キーワード: C型肝炎 / 遺伝子変異 / 次世代シーケンサー / quasispecies

研究概要

C型肝炎の治療法は、インターフェロン・リバビリンに加えC型肝炎ウイルス（Hepatits C virus; HCV)に直接作用するDAAs（Direct Actng Antivirus)の開発が進んでいる。とくにNS3-4 protease阻害剤であるTalaprevirはPEG-IFNRBVとの併用で用いられるようになったが、その治療効果はPEG-IFN+RBV療法と同様、HCV遺伝子変異が関連することが明らかになった。とくにNS5A遺伝子内のインターフェロン感受性決定領域（Interferon Sensitivity Determining Region, ISDR）、インターフェロン・リバビリン耐性決定領域（Interferon-ribavirin resistsnse determining region)の変異のみならずCore領域の変異（R70Q）が関与していることが臨床的に明らかになっているが、この変異はNS3 protease阻害剤の治療効果とも関連することが指摘されている。さらにCoreアミノ酸変異は、宿主のインターフェロンの感受性を規定するIL28B SNPとも関連することが指摘されており、HCVの遺伝子変異が宿主とインターフェロン感受性とも何らかの関連があることが推測されている。これまでに次世代シーケンサーを用い、Core 70変異が多数の変異体の集合体（quasispecies）の状態であることを確認し、少数の変異の集合体が治療効果と関連することを明らかにした。しかもこの変異は独立した変異で、他のIFN感受性クローンを代表する表現形ではないことを示唆する結果を得た。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

本研究の目的は、HCV薬剤耐性機構の解明にあるが、次世代シーケンサーを用いて、これまで知られていなかった、変異体の集合状態（quasispecies）の状態が、C型肝炎に対する治療効果と密接に関連することを明らかにできた。今後、順次使用可能となるDAAにおいても検証できるような実験系の整備が完了し、本年度以降の研究体制も整ったため、研究計画は概ね順調に進展している。

今後の研究の推進方策

今後は、DAAを用いた症例でHCV遺伝子変異の網羅的解析と分子機構の解明をおこなう。すなわち、臨床的には、2011年末から開始しているPEG-IFN＋RBV＋DAA併用治療によるHCV遺伝子変異の出現と治療効果につき検討し、薬剤耐性変異の出現とウイルス増殖・治療効果の関連について、次世代シーケンサーを用いて解析する。とくに本年までに実施すみのISDR/IRRDR、Coreアミノ酸変異とこの変異体の集合状況（quasispecies）と変異率について、高速詳細に検討すことは次世代シーケンサーを用いた解析手法により初めて明らかにできるものである。さらに、HCVレプリコンを用いてこれら遺伝子変異をHCV増殖能の検討を行う。すなわち、これら薬剤存在下にレプリコン持続増殖をおこなった細胞からHCV レプリコン遺伝子を回収、変異部位を同定し順次、レプリコンに導入することにより治療反応性を変化させる変異部位を特定し、遺伝子変異とウイルス増殖能・耐性変異との関連を明らかにする。また、臨床的に、インターフェロン・リバビリン・DAAが無効であった患者血清から得られたHCVを用いて、このHCV遺伝子をレプリコン化して、in vitroでの治療反応性を検討、薬剤抵抗性HCV遺伝子の特徴と機能を明らかにすることを計画している。とくに、インターフェロン治療効果は、上記のHCV増殖能のほかにHCV遺伝子型によっても規定されていることからHCV遺伝子型の相違によるウイルス増殖能およびインターフェロン反応性を検討する。さらに、臨床的にインターフェロン耐性を示すISDR野生型のNS5A蛋白、インターフェロン感受性を呈するISDR変異型NS5A蛋白のHCV レプリコン増殖に対する作用やインターフェロンに対する反応性をも解析する。
なお、本研究に必要な物品費はすべて消耗品類の購入に使用する予定である。

次年度の研究費の使用計画

該当なし

研究成果

• [雑誌論文] IL28B(IFN-λ3)and IFN-α synergisitically inhibit HCV replication. (2013)
  • 著者名/発表者名: Shindo H , Maekawa S, Komase K, Miura M, Sueki K, Komatsu K, Shindo K, Amemiya F, Nakayama T, Inoue T, Sakamoto M , Yamashita A, Moriishi K, Enomoto N
  • 雑誌名: J Viral hepatitis. 巻: 印刷中 ページ: 印刷中
  • DOI: 10.1111/j.1365-2893.2012.01649.x
  • 査読あり
• [雑誌論文] Age and total ribavirin dose are independent predictors of relapse after interferon therapy in chronic hepatitis C revealed by data mining analysis. (2012)
  • 著者名/発表者名: Kurosaki M, Hiramatsu N, Sakamoto M, Suzuki Y, Iwasaki M, Tamori A, Matsuura K, Sugauchi F, Sakamoto N, Yatsuhashi H, Izumi N
  • 雑誌名: Antiviral Therapy 巻: 17 ページ: 35-43
  • DOI: 10.3851/IMP1923
  • 査読あり
• [雑誌論文] Analysis of viral amino acids sequences and the IL28B SNP influencing the development of hepatocellular carcinoma in chronic hepatitis C. (2012)
  • 著者名/発表者名: Miura M, Maekawa S, Kadokura M, Sueki R, Komase K, Shindo H, Ohmori T, Kanayama A, Shindo K, Amemiya F, Nakayama Y, Kitamura T, Uetake T, Inoue T, Sakamoto M, Okada S, Enomoto N
  • 雑誌名: Hepatol Int 巻: 6 ページ: 386-396
  • DOI: 10.1007/s12072-011-9307-6
  • 査読あり
• [雑誌論文] Characterization of naturally occurring protease inhibitor-resistance mutations in genotype 1b hepatitis C virus patients. (2012)
  • 著者名/発表者名: Shindo H, Maekawa S, Komase K, Sueki R, Miura M, Kadokura M, Shindo K, Amemiya F, Kitamura T, Nakayama Y, Inoue T, Sakamoto M, Okada S, Asahina Y, Izumi N, Honda M, Kaneko S, Enomoto N
  • 雑誌名: Hepatol Int 巻: 6 ページ: 482-490
  • DOI: 10.1007/s12072-011-9306-7
  • 査読あり
• [雑誌論文] Causes of thrombocytopenia in chronic hepatitis C viral infection. (2012)
  • 著者名/発表者名: Osada M, Kaneko M, Sakamoto M, Endoh M, Takigawa K, Inoue-Suzuki K, Inoue O, Satoh K, Enomoto N, Yatomi Y, Ozaki Y
  • 雑誌名: Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis 巻: 18 ページ: 272-280
  • DOI: 10.1177/1076029611429124
  • 査読あり
• [雑誌論文] Data mining model using simple and readily available factors could identify patients at high risk for hepatocellular carcinoma in chronic hepatitis C. (2012)
  • 著者名/発表者名: Kurosaki M, Hiramatsu N, Sakamoto M, Suzuki Y, Iwasaki M, Tamori A, Matsuura K, Kakinuma S, Sugauchi F, Sakamoto N, Nakagawa M, Izumi N
  • 雑誌名: J Hepatol 巻: 56 ページ: 602-608
  • DOI: 10/1016/j.jhep.2011.09.011
  • 査読あり
• [雑誌論文] Comprehensive analysis for viral elements and IL28B polymorphisms in response to peginterferon plus ribavirin therapy in HCV-1b infection. (2012)
  • 著者名/発表者名: Maekawa S, Sakamoto M, Miura M, Kadokura M, Sueki R, Komase K, Shindo H, Komatsu N, Shindo K, Amemiya F, Takano S, Yamaguchi T, Nakayama Y, Kitamura T, Inoue T, Okada S, Enomoto N
  • 雑誌名: Hepatology 巻: 56 ページ: 1611-1621
  • 査読あり
• [雑誌論文] 抗HCV薬、特集：抗ウイルス薬 (2012)
  • 著者名/発表者名: 坂本穣、榎本信幸
  • 雑誌名: 日本臨床 巻: 70 ページ: 614-619
• [雑誌論文] ウイルス変異と宿主ゲノム解析からみたPEG-IFN+RBV療法とProtease阻害剤の適応 (2012)
  • 著者名/発表者名: 坂本穣、榎本信幸
  • 雑誌名: 消化器内科 巻: 54 ページ: 454-458
• [雑誌論文] C型肝炎の個別化治療－肝発がんの危険性とウイルス排除の可能性を考慮して－ (2012)
  • 著者名/発表者名: 坂本穣、榎本信幸
  • 雑誌名: Medical Practuce 巻: 29 ページ: 1048－1049
• [雑誌論文] ペグインターフェロン＋リバビリン＋テラプレビル併用療法－宿主・ウイルス因子の解析からみた最適な治療 (2012)
  • 著者名/発表者名: 坂本穣、榎本信幸
  • 雑誌名: 消化器の臨床 巻: 15 ページ: 249-256
• [学会発表] ウイルス変異と宿主ゲノムから見たPEG-IFN+RBV療法の治療成績と発癌リスクを考慮した新規治療法.
  • 著者名/発表者名: 坂本穣、前川伸哉、榎本信幸
  • 学会等名: 第98回日本消化器病学会総会（シンポジウム）
  • 発表場所: 京王プラザホテル（東京都）
• [学会発表] IL28B (IFNλ-3) and IFN-α Synergistically Inhibit HCV Replication.
  • 著者名/発表者名: Shindo H, Maekawa S, Komatsu N, Komase K, Miura M, Kadokura M, Sueki R, Shindo K, Amemiya F, Nakayama Y, Inoue T, Sakamoto M, Yamashita A, Moriishi K, Enomoto N
  • 学会等名: The 3rd International Forum
  • 発表場所: 京王プラザホテル（東京都）
• [学会発表] 臨床背景とウイルス変異・宿主ゲノムからみたC型肝炎に対する治療選択
  • 著者名/発表者名: 坂本穣、前川伸哉、榎本信幸
  • 学会等名: 第48回日本肝臓学会総会（ワークショップ）
  • 発表場所: 石川県立音楽堂他（石川県）
• [学会発表] 次世代シークエンサーを用いた肝発癌に関連するHCV遺伝子変異の解析
  • 著者名/発表者名: 三浦美香、前川伸哉、門倉信、末木良太、小馬瀬一樹、進藤浩子、進藤邦明、雨宮史武、中山康弘、植竹智義、井上泰輔、坂本穣、榎本信幸
  • 学会等名: 第48回日本肝臓学会総会（ワークショップ）
  • 発表場所: 石川県立音楽堂他（石川県）
• [学会発表] 次世代シークエンサーを用いたTelaprevir耐性変異株の検討
  • 著者名/発表者名: 小松信俊、前川伸哉、進藤邦明、三浦美香、雨宮史武、中山康弘、井上泰輔、坂本穣、榎本信幸
  • 学会等名: 第48回日本肝臓学会総会（ワークショップ）
  • 発表場所: 石川県立音楽堂他（石川県）
• [学会発表] 発癌リスクとウイルス排除の可能性からみた最新のC型肝炎治療
  • 著者名/発表者名: 坂本穣、前川伸哉、榎本信幸
  • 学会等名: 第16回日本肝臓学会大会（JDDW2012）（シンポジウム）
  • 発表場所: 神戸国際会議場他（兵庫県）
• [学会発表] 高齢C型肝炎に対するインターフェロン治療の検討
  • 著者名/発表者名: 井上泰輔、坂本穣、榎本信幸
  • 学会等名: 第16回日本肝臓学会大会（JDDW2012）（ワークショップ）
  • 発表場所: 神戸国際会議場他（兵庫県）
• [学会発表] 次世代deep sequencerを用いたTelaprevir耐性変異株の検討
  • 著者名/発表者名: 小松信俊、前川伸哉、三浦美香、進藤邦明、雨宮史武、中山康弘、井上泰輔、坂本穣、榎本信幸
  • 学会等名: 第16回日本肝臓学会大会（JDDW2012）
  • 発表場所: 神戸国際会議場他（兵庫県）
• [学会発表] 次世代シークエンサーを用いた肝発癌に関連するHCV遺伝子変異の解析
  • 著者名/発表者名: 三浦美香、前川伸哉、小松信俊、進藤邦明、雨宮史武、中山康弘、井上泰輔、坂本穣、榎本信幸.
  • 学会等名: 第16回日本肝臓学会大会（JDDW2012）
  • 発表場所: 神戸国際会議場他（兵庫県）
• [図書] ウイルス肝炎治療薬、薬物治療と薬理メカニズム、カラー版内科学（門脇孝・永井良三総編集） (2012)
  • 著者名/発表者名: 坂本穣、榎本信幸
  • 総ページ数: 1929
  • 出版者: 西村書店
• [備考] 山梨大学研究者総覧
  • URL: http://erdb.yamanashi.ac.jp/rdb/A_DispDetail.Scholar
• [備考] 山梨大学医学部内科学教室第1教室
  • URL: http://www.ichinai-yamanashi.com/
• [備考] 山梨大学医学部附属病院肝疾患センター
  • URL: http://www.hosp.yamanashi.ac.jp/chuo_shinryo/kan/index.html