包括的エピゲノム解析に基づいた脂肪性肝疾患からの肝発癌予測因子の同定

2013 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 24590997
• 研究機関: 近畿大学
• 研究代表者: 西田 直生志 近畿大学, 医学部, 准教授 (60281755)
• 研究分担者: 波多野 悦朗 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (80359801)
• キーワード: 肝細胞癌 / DNAメチル化 / 脂肪肝 / 糖尿病

研究概要

エピゲノム解析に基づき、脂肪性肝疾患からの発癌予測因子を絞り込むため、非ウイルス性肝癌（NBNC肝癌）の背景肝のメチル化の差異に影響を及ぼす臨床背景を明らかにした。肝癌(HCC)、その非癌部肝（ウイルス性37例、NBNC22例）を用い、DNAメチル化profileをイルミナ社HM BeadChip450を用い解析した。癌と非癌間でメチル化に差異のあるCpGを、β値の差とU検定の補正q値で抽出した。次にNBNC、およびウイルス陽性HCCの非癌部を、臨床背景別に群別し、上記で抽出したCpGのうち、各群間で差のあるものをU検定で抽出した。5種のHCC細胞株を脱メチル化処理し、発現が回復する遺伝子を、発現アレイを用いて解析した。この結果、癌部でメチル化が上昇する3052 CpG、低下する35279 CpGを抽出した。これらの内、NBNC非癌部で、年齢(≧70才)により差異のあるCpGが6517部位、糖尿病歴で47部位が抽出された。一方、性、飲酒歴、BMI、線維化別では差異のあるCpGは抽出されなかった。ウイルス陽性非癌部では、HBV/HCV:11164部位、線維化の程度：2896部位が抽出された。NBNC非癌部で、年齢がメチル化レベルに影響する遺伝子の中で、HCC細胞株の脱メチル化処理により発現が回復するものが111種、糖尿病がメチル化に影響する遺伝子で、脱メチル化処理により発現が回復する遺伝子が4種同定された。これらの結果より、ウイルス陽性例では、ウイルス種がエピゲノムprofileと関連するのに対し、NBNC非癌部では飲酒での差は認められなかった。一方、加齢や糖尿病の有無は、背景肝のエピゲノムprofileに影響し、その内のいくつかの遺伝子は、HCC細胞株でメチル化により不活性化しており、加齢や糖尿病が、DNAメチル化を介した発癌に寄与する可能性が示唆される。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

昨年度はNAFLD関連肝癌、及び非癌部肝組織から高分子DNAを抽出、bisulfite処理を行い、全ゲノムにわたり、遺伝子プロモーター上のCpG部位のメチル化レベルを網羅的に解析する予定であったが、サンプルサイズが小さく、十分な解析ができなかった。本年度はウイルス性肝癌37例、非ウイルス性肝癌２2例を収集し、約45万のCpG部位のDNAメチル化レベルを、HM BeadChip450を用い解析した。さらに癌-非癌でメチル化レベルに差異のあるCpGを、β値の差＞0.15かつU検定とFDR法による補正q値＜1.0E-12を基準として抽出し、癌部に特徴的なメチル化の変化が生じるCpG部位を絞り込んだ。次にNBNC、およびウイルス陽性HCCの非癌部を、臨床背景別（糖尿病、BMI≧25、飲酒歴、HBV/HCV、性、年齢≧70才、F stage）に群別し、上記で抽出したCpGのうち、各群間で差のあるものをU検定のp＜0.01かつBH FDR法の補正q＜0.35で抽出した。さらに、これらのCpG部位の内、癌部でメチル化が上昇する部位に関して、そのメチル化の変化が対応する遺伝子の転写抑制を誘導しているかを確認するため、5種のHCC細胞株を脱メチル化処理し、発現が回復する遺伝子を、SurePrint G3 発現アレイを用いて網羅的に解析し、メチル化により不活化されていると考えられる遺伝子を抽出した。

今後の研究の推進方策

本年度の成果により、上記の肝癌と非癌部でメチル化レベルに差があるCpGのなかでは、癌部でメチル化が上昇し、さらに非癌部とのβ値の差異が0.25以上かつ癌部と非癌部の差が補正q値で1E-13以下のCpGは1171部位であった。これらのCpGの存在する遺伝子のなかで、５種の肝癌細胞株を脱メチル化処理し、３種以上の細胞株で２倍以上の発現回復する遺伝子を基準に、さらに異常メチル化を示す遺伝子を絞り込み、そのメチル化が遺伝子の5’側に領域性をもって認められるものを選択して、最終的に、肝発癌に重要と思われる異常メチル化を示す遺伝子を70種まで絞り込んだ。今後は、これらに遺伝子の機能、および脂肪性肝炎における不活性化の有無を検討する予定である。

次年度の研究費の使用計画

ビーズアレイによるメチル化解析、およびマイクロアレイによる遺伝子発現解析後の統計解析に使用予定の金額であったが、アレイのデータ収集の時期が１ヶ月遅れたため、未使用分として残った。
現在すでにこの解析の為に使用しており、４月中に執行予定である。

研究成果

• [雑誌論文] Heat Shock Protein 27 Expression is Inversely Correlated with Atrophic Gastritis and Intraepithelial Neoplasia. (2013)
  • 著者名/発表者名: Nagata Y, Kudo M, Nagai T, Watanabe T, Kawasaki M, Asakuma Y, Hagiwara S, Nishida N, Matsui S, Kashida H, Sakurai T.
  • 雑誌名: Dig Dis Sci. 巻: 58 ページ: 381-388
  • DOI: 10.1007/s10620-012-2342-x
  • 査読あり
• [雑誌論文] Recent advancements in comprehensive genetic analyses for human hepatocellular carcinoma. (2013)
  • 著者名/発表者名: Nishida N and Kudo M
  • 雑誌名: Oncology 巻: 84 ページ: 93-97
  • DOI: 10.1159/000345897
  • 査読あり
• [雑誌論文] The prognostic value of vascular endothelial growth factor in hepatocellular carcinoma for predicting metastasis after curative resection. (2013)
  • 著者名/発表者名: Minata M, Harada K, Kudo M, Ikai I, and Nishida N
  • 雑誌名: Oncology 巻: 84 ページ: 71-78
  • DOI: 10.1159/000345894.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Expression of E-cadherin and vascular endothelial growth factor in non-cancerous liver is associated with recurrence of HCC after curative resection. (2013)
  • 著者名/発表者名: Minata M, Kudo M, Harada K, Ikai I, and Nishida N
  • 雑誌名: Oncology 巻: 84 ページ: 88-92
  • DOI: 10.1159/000345896
  • 査読あり
• [雑誌論文] Quantification of tumor DNA in serum and vascular invasion of human hepatocellular carcinoma. (2013)
  • 著者名/発表者名: Nishida N, Arizumi T, Takita M, Nagai M, Kitai S, Yada N, Hagiwara S, Inoue T, Minami Y, Ueshima K, Sakurai T, Ida, H, and Kudo M.
  • 雑誌名: Oncology 巻: 84 ページ: 81-87
  • DOI: 10.1159/000345895
  • 査読あり
• [雑誌論文] Usefulness of Contrast-Enhanced Ultrasonography to Evaluate the Post-Treatment Responses of Radiofrequency Ablation for Hepatocellular Carcinoma: Comparison with Dynamic CT. (2013)
  • 著者名/発表者名: Inoue T, Kudo M, Hatanaka K, Arizumi T, Takata M, Titai S, Yada N, Hagiwara S, Minami Y, Sakurai T, Ueshima K, Nishida N.
  • 雑誌名: Oncology 巻: 84 ページ: 51-57
  • DOI: 10.1159/000345890
  • 査読あり
• [雑誌論文] Impact of Combination Therapy with Peginterferon alpha-2b and Entecavir on Persistent Viral Suppression in Patients with Chronic Hepatitis B. (2013)
  • 著者名/発表者名: Hagiwara S, Kudo M, Osaki Y, Matsuo H, Inuzuka T, Matsumoto A, Tanaka E, Sakurai, Ueshima K, Inoue T, Yada N, Nishida N
  • 雑誌名: J Med Virol. 巻: 85 ページ: 987-995
  • DOI: 10.1002/jmv.23564
  • 査読あり
• [雑誌論文] Association between Gankyrin and Stemness factor expression in human colorectal cancer. (2013)
  • 著者名/発表者名: Mine H, Sakurai T, Kashida H, Matsui S, Nishida N, Nagai T, Hagiwara S, Watanabe T, Kudo M
  • 雑誌名: Dis Dis Sci 巻: 58 ページ: 2337-2344
  • DOI: 10.1007/s10620-013-2627-8
  • 査読あり
• [雑誌論文] Advanced hepatocellular carcinoma with lymph node metastases showing epithelial to mesenchymal transition effectively treated with systemic chemotherapy: report of a case. (2013)
  • 著者名/発表者名: Sadamori H, Yagi T, Shigeyasu K, Umeda Y, Sugihara M, Yokomichi N, Ohara T, Nishida N, Nagasaka T, Goel A, Fujiwara T
  • 雑誌名: Hepatol Res 巻: 43 ページ: 1368-1373
  • DOI: 10.1111/hepr.12080
  • 査読あり
• [雑誌論文] Unique association between global DNA hypomethylation and chromosomal alterations in human hepatocellular carcinoma. (2013)
  • 著者名/発表者名: Nishida N, Kudo M, Nishimura T, Arizumi T, Takita M, Kitai S, Yada N, Hagiwara S, Inoue T, Minami Y, Ueshima K, Sakurai T, Yokomichi N, Nagasaka T, Goel A.
  • 雑誌名: PLoS One 巻: 8 ページ: e72312
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0072312
  • 査読あり
• [雑誌論文] Reactive Oxygen Species Induce Epigenetic Instability through the Formation of 8-Hydroxydeoxyguanosine in Human Hepatocarcinogenesis. (2013)
  • 著者名/発表者名: Nishida N, Arizumi T, Takita M, Kitai S, Yada N, Hagiwara S, Inoue T, Minami Y, Ueshima K, Sakurai T, Kudo M.
  • 雑誌名: Dig Dis. 巻: 31 ページ: 459-466
  • DOI: 10.1159/000355245
  • 査読あり
• [雑誌論文] Oxidative stress and epigenetic instability in human hepatocarcinogenesis. (2013)
  • 著者名/発表者名: Nishida N, Kudo M.
  • 雑誌名: Dig Dis. 巻: 31 ページ: 447-453
  • DOI: 10.1159/000355243
  • 査読あり
• [雑誌論文] Hypothermia Protects against Fulminant Hepatitis in Mice by Reducing Reactive Oxygen Species Production. (2013)
  • 著者名/発表者名: Sakurai T, Kudo M, Watanabe T, Itoh K, Higashitsuji H, Arizumi T, Inoue T, Hagiwara S, Ueshima K, Nishida N, Fukumoto M, Fujita J.
  • 雑誌名: Dig Dis. 巻: 31 ページ: 440-446
  • DOI: 10.1159/000355242
  • 査読あり
• [雑誌論文] Clinical and histological features of different types of budd-Chiari syndrome: a comparison of 4 cases. (2013)
  • 著者名/発表者名: Nishida N, Iwamura S, Ida H, Hagiwara S, Kagioka Y, Minami Y, Maetani Y, Itoh K, Kudo M.
  • 雑誌名: Dig Dis. 巻: 31 ページ: 408-414
  • DOI: 10.1159/000355237
  • 査読あり
• [学会発表] Role of oxidative stress and epigenetic alteration on chronic hepatitis C-related human hepatocarcinogenesis. (2013)
  • 著者名/発表者名: Naoshi Nishida
  • 学会等名: 64th Annual meeting of the American Association for the Study of Liver Diseases (AASLD)
  • 発表場所: Convention Center, Washington, D.C
  • 年月日: 20131101-20131105
• [学会発表] Unique association between global DNA hypomethylation and chromosomal alterations in human hepatocellular carcinoma. (2013)
  • 著者名/発表者名: Naoshi Nishida
  • 学会等名: 7th ILCA (International Liver Cancer Association) Annual Conference
  • 発表場所: Convention Center, Washington, D.C
  • 年月日: 20130913-20130916
• [学会発表] ヒト肝癌に認められるゲノムワイドな脱メチル化と染色体不安定性の関連 (2013)
  • 著者名/発表者名: 西田直生志
  • 学会等名: 第49回日本肝臓学会総会
  • 発表場所: 京王プラザホテル（東京都新宿区）
  • 年月日: 20130606-20130607
• [備考] 消化器内科研究内容
  • URL: http://www.med.kindai.ac.jp/shoukaki//research/index.html