| 今後の研究の推進方策 |
（1）候補蛋白の siRNA、特異的阻害剤による細胞内HCV複製の阻害効果；同定した宿主因子について、siRNAを合成し、レプリコン細胞へ導入する。目的蛋白質の十分な発現低下を確認した後、HCV-RNA量への影響をリアルタイムRT-PCR法で解析する。さらに、特異的な阻害剤が存在する蛋白については、それを用いて複製に与える影響を調べる。
（2) 候補蛋白およびそのdominant negative体などの強制発現による細胞内HCV複製へ与える影響；同定した宿主因子をレプリコン細胞で強制発現させ、HCV-RNA量への影響をリアルタイムRT-PCR法で解析する。
（3）HCV複製複合体と同定した宿主蛋白の細胞内局在の免疫組織学的な観察；レプリコン細胞内で複製しているHCVゲノムをアクティブな状態で観察するため、Actinomycin D処理して細胞内のDNA dependent RNA polymeraseを抑えた上で、bromouridine triphosphate (BrUTP)を細胞に導入し、免疫組織染色で観察する。BrUTPが取り込まれた新規に合成されたHCVRNAと宿主因子の細胞内局在を蛍光顕微鏡で観察する。
３）宿主因子とHCV非構造蛋白、HCV-RNAとの相互作用の解析；(2)の解析を通じて、HCV複製に関与していることが示された因子について、HCV非構造蛋白質（NS3, 4A, 4B, 5A, 5B）との相互作用をエピトーグタグ免疫沈降法、two-hybrid法、pull-down法などで解析する。各NS蛋白の免疫沈降法の条件検討も終わっている。HCV-RNAと宿主蛋白の結合について、UV クロスリンク法で解析する。
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