研究課題
我々はこれまでに、C型肝炎ウイルスが細胞内のER膜をMembranus webと言う胞状の袋に変化さえ、この内部で複製を行っていることを見出してきた。複製はウイルスRNA合成と蛋白翻訳の２つのステップに分けられる。しかしながら、それらの調整機構はわかっていない。そこで、複製に必須と考えられているNS5Aに注目し、HCV生活環に関与する宿主因子の同定のため、膜画分に含まれる蛋白のうちNS5A蛋白に結合する宿主因子を検索し、20種の新規宿主因子を同定した。同定された宿主蛋白についてsiRNAを用いてウイルスRNA合成と蛋白翻訳への関与を解析したところ、ELAVL1およびRCN1の蛋白が翻訳に、ATAD3A、ELAVL1TBL２、RCN1、FKBP８の蛋白がウイルスRNA合成に重要な役割を果たしていることを見出した。翻訳に関与する２種類の蛋白はいずれもウイルスRNA合成に影響を与えていた。今後はそのメカニズムの詳細を明らかにし、宿主因子を標的とした創薬の可能性についても検討していく予定である。
2: おおむね順調に進展している
昨年度までに、pull-down法によりNS5A蛋白と特異的に共沈する膜蛋白質をプロテオーム解析した結果、20種の新規宿主因子を同定し、siRNAを用いてスクルーニングしたところ、ELAVL1およびRCN1の蛋白が翻訳に、ATAD3A、ELAVL1、TBL２、RCN1、FKBP８の蛋白がウイルスRNA合成に重要な役割を果たしていることを見出した。さらに、スクリーニングで絞られた候補蛋白について、感染細胞、レプリコン細胞等、細胞培養系を用いて、shRNAや野生型/dominant negative体の発現プラスミドでウイルス産生への関与が確認できた。候補蛋白の複製、翻訳における影響をin vivoで確認できたので、ほぼ２年目の目標は達成した。
（１）これまでに、候補蛋白の感染細胞、レプリコン細胞内における複製および翻訳に与える影響についてのin vivo解析が終了した。最終年度の本年度は、試験管内翻訳系、cell-free replication assayを行い、in vitroでの解析を行い、その複製および翻訳のスイッチングにおける役割を解析する。（２）HCV複製複合体と同定した宿主蛋白の細胞内局在の免疫組織学的な観察;レプリコン細胞内で複製しているHCVゲノムをアクティブな状態で観察するため、Actinomycin D処理して細胞内のDNA dependent RNA polymeraseを抑えた上で、bromouridine triphosphat e (BrUTP)を細胞に導入し、免疫組織染色で観察する。BrUTPが取り込まれた新規に合成されたHCVRNAと宿主因子の細胞内局在を蛍光顕微鏡で観察する。（３）宿主因子とHCV非構造蛋白、HCV-RNAとの相互作用の解析; (2)の解析を通じて、HCV複製に関与していることが示された因子について、HCV非構造蛋白質(NS3, 4A, 4B, 5A, 5B)との相互作用をエピトーグタグ免疫沈降法、two-hybrid法、pull-down法などで解析する。各NS蛋白の免疫沈降法の条件検討も終わっている。HCV-RNAと宿主蛋白の結合について、UVクロスリンク法で解析する。
すでに実験系が確立しているin vivo実験でこれまでの結果を確認する作業を優先したため、昨年度は当初の予定より少ない使用額となった。本年度からin vitro実験を介している。薬品類として2D-DIGE関連試薬、ウシ胎児血清、DMEM、TaqMan-PCR試薬、ELISA関連試薬、蛋白精製関連試薬等を購入する。プラスチッ ク器具類として、細胞培養容器、ピペット類、手袋等を購入予定である。
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