複製活性を保持した精製複製複合体からＨＣＶ複製に関与する宿主因子の同定と解析

2014 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 24591001
• 研究機関: 国立感染症研究所
• 研究代表者: 相崎 英樹 国立感染症研究所, その他部局等, その他 (00333360)
• 研究期間 (年度): 2012-04-01 – 2016-03-31
• キーワード: C型肝炎ウイルス

研究実績の概要

ウイルスの複製はウイルスRNA合成と蛋白翻訳の2つのステップに分けられる。しかしながら、それらの調整機構はわかっていない。そこで、複製に必須と考えられているNS5Aに注目し、HCV生活環に関与する宿主因子の同定のため、膜画分に含まれる蛋白のうちNS5 A蛋白に結合する宿主因子を検索し、20種の新規宿主因子を同定した。同定された宿主蛋白についてsiRNAを用いてウイルスRNA合成と蛋白翻訳への関与を解析したところ、ELAVL1、RCN1の蛋白が翻訳に、ATAD3A、ELAVL1、TBL2、RCN1、FKBP8の蛋白がウイルスRNA合成に重要な役割を果たしていることを見出した。共通するタンパクembryonic lethal, abnormal vision, drosophila-like 1 (ELAVL1)に注目して解析を行った。ELAVL1はゲノム複製により新規合成されたHCV RNAと結合して、ウイルスタンパク質翻訳を誘導した。さらに、ELAVL1は産生されたNSタンパク質と結合して、HCV RNAを複製複合体へリクルートするものと考えられた。以上のように、ELAVL1はHCV RNAの翻訳・複製を調節する宿主因子である可能性が示唆された。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

スクリーニングで絞られた候補蛋白のうちELAVL1は、感染細胞、レプリコン細胞等、細胞培養系を用いて、shRNAや野生型/dominant negative体の発現プラスミドでウイルス翻訳・複製への関与が確認できた。ELAVL1の複製、翻訳の調整メカニズムを解析できた。一方、恒常的にタンパク質を発現する発現株の取得に時間がかかったため、実験が期限内に終わらず、延長を希望した。

今後の研究の推進方策

本研究３年間で、NS5A発現細胞からpull-down法によりNS5A結合膜タンパク質を精製し, プロテオーム解析、siRNA screeningにより翻訳および複製に関与しているタンパク質としてembryonic lethal, abnormal vision, drosophila-like 1 (ELAVL1)を見出した。ELAVL1はRNAに結合し安定性や翻訳に関与していることが知られている。ELAVL1はHuh7細胞で主に細胞質に存在していたものの、レプリコン細胞ではHCV複製複合体が存在する界面活性剤不溶性分画(DRM)に移行していた。ELAVL1はそのRNA recognition motif 1 (RRM1)、RRM2、Hinge domain (HD)で、それぞれHCVRNA、NS3、NS5Aと結合した。ELAVL1ノックダウンレプリコン細胞に各種ELAVL1欠損変異体を導入したところ、RRM2、HD欠損体では翻訳が復活したものの、複製は復活しなかった。さらに、レプリコン細胞にHD欠損ELAVL1を導入したところ、ELAVL1はDRMで検出されず、RRM1、RRM2、HD欠損ELAVL1を導入したところ、HCV RNAはDRMで検出できなくなった。HCV RNAのDRMへの移行には、ELAVL1が HCV RNAと結合し、さらにNSタンパク質と結合することが必要と考えられた。ELAVL1はゲノム複製により新規合成されたHCV RNAと結合して、ウイルスタンパク質翻訳を誘導する。さらに、ELAVL1は産生されたNSタンパク質と結合して、HCV RNAを複製複合体へリクルートするものと考えられた。今後は、免疫電顕を用いて、ELAVL1の翻訳・複製における細胞内局在変化を観察し、ELAVL1の翻訳・複製を調節機構の解明を目指す。

次年度使用額が生じた理由

目的のタンパク発現のウイルス増殖に与える影響を調べるため細胞にタンパク発現プラスミドを強制発現させたが十分な発現が得られなかった。そこで抗生剤体制遺伝子を挿入し、恒常的タンパク発現細胞株を所得した。安定発現株の取得に時間がかかったため、実験が期限内に終わらず、延長した。

次年度使用額の使用計画

ELAVL1恒常的タンパク発現細胞株を用いてHCV感染増殖実験を行い、ELAVL1の増殖における役割を解析する。そのため、培養液、抗生剤、フラスコ等の購入をおこなう。また、研究の成果を公開・情報交換し、他の研究者の研究にも役立てるため、国際学会、国内学会に参加し発表、情報を交換する。

研究成果

• [雑誌論文] Dysregulation of Retinoic Acid Receptor Diminishes Hepatocyte Permissiveness to Hepatitis B Virus Infection through Modulation of NTCP Expression. (2015)
  • 著者名/発表者名: Tsukuda S, Watashi K, Iwamoto M, Suzuki R, Aizaki H, Okada M, Sugiyama M, Kojima S, Tanaka Y, Mizokami M, Li J, Tong S, Wakita T.
  • 雑誌名: J Biol Chem. 巻: 290 ページ: 5673-84
  • 査読あり / 国際共著 / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Targeting cellular squalene synthase, an enzyme essential for cholesterol biosynthesis, is a potential antiviral strategy against hepatitis C virus. (2015)
  • 著者名/発表者名: Saito K, Shirasago Y, Suzuki T, Aizaki H, Hanada K, Wakita T, Nishijima M, Fukasawa M.
  • 雑誌名: J Virol. 巻: 89 ページ: 2220-32
  • 査読あり / 国際共著 / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Production of single-round infectious chimeric flaviviruses with DNA-based Japanese encephalitis virus replicon. (2014)
  • 著者名/発表者名: Suzuki R, Ishikawa T, Konishi E, Matsuda M, Watashi K, Aizaki H, Takasaki T, Wakita T.
  • 雑誌名: J Gen Virol. 巻: 95 ページ: 60-65
  • DOI: 10.1099/vir.0.058008-0
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Alternative endocytosis pathway for productive entry of hepatitis C virus. (2014)
  • 著者名/発表者名: Matsuda M, Suzuki R, Kataoka C, Watashi K, Aizaki H, Kato N, Matsuura Y, Suzuki T, Wakita T.
  • 雑誌名: J Gen Virol. 巻: 95 ページ: 2658-67
  • DOI: 10.1099/vir.0.068528-0
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Development of Hepatitis C Virus Genotype 3a Cell Culture System. (2014)
  • 著者名/発表者名: Kim S, Date T, Yokokawa H, Kono T, Aizaki H, Maurel P, Gondeau C, Wakita T
  • 雑誌名: Hepatology 巻: 60 ページ: 1838-50
  • DOI: 10.1002/hep.27197
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Involvement of MAP3K8 and miR-17-5p in poor virologic response to interferon-based combination therapy for chronic hepatitis C. (2014)
  • 著者名/発表者名: Tsubota A, Mogushi K, Aizaki H, Miyaguchi K, Nagatsuma K, Matsudaira H, Kushida T, Furihata T, Tanaka H, Matsuura T.
  • 雑誌名: PLoS One. 巻: 12 ページ: e97078
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0097078
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Evaluation and Identification of hepatitis B virus entry inhibitors using HepG2 cells overexpressing a membrane transporter NTCP (2014)
  • 著者名/発表者名: Iwamoto M, Watashi K, Tsukuda S, Aly1 HH, Fukasawa M, Suzuki R, Aizaki H, Ito T, Koiwai O, Kusuhara H, Wakita T,
  • 雑誌名: Biochem Biophys Res Commun. 巻: 443 ページ: 808-13
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2013.12.052
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Nanoimaging of ssRNA: Genome Architecture of the Hepatitis C Virus Revealed by Atomic Force Microscopy. (2014)
  • 著者名/発表者名: Gilmore1 JL, Aizaki H, Yoshida1 A, Deguchi K, Kumeta M, Junghof J, Wakita T, Takeyasu K.
  • 雑誌名: J Nanomed Nanotechol. 巻: doi:10.4172 ページ: S5-010
  • DOI: 10.4172/2157-7439.
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [学会発表] Retinoic acid receptor plays an important role in mediating hepatitis B virus infection through regulation of NTCP expression. (2014)
  • 著者名/発表者名: Tsukuda S, Watashi K, Iwamoto M, Suzuki R, Aizaki H, Kojima S, Sugiyama M, Tanaka Y, Mizokami M, Wakita T.
  • 学会等名: The 11th JSH Single Topic Conference
  • 発表場所: 広島
  • 年月日: 2014-11-20 – 2014-11-21
• [学会発表] E1ペプチドによるHCV感染阻害機構の解析 (2014)
  • 著者名/発表者名: 渡邉則幸、伊達朋子、河野環、溝上雅史 、相崎英樹、脇田隆字
  • 学会等名: 第62回日本ウイルス学会学術集会
  • 発表場所: 横浜
  • 年月日: 2014-11-10 – 2014-11-12
• [学会発表] Aryl hydrocarbon receptor による脂肪滴形成及び C 型肝炎ウイルス粒子構築の制御 (2014)
  • 著者名/発表者名: 大橋啓史、渡士幸一、中嶋翔、金ソルイ、鈴木亮介、相崎英樹、紙透伸治、菅原二三男、脇田隆字
  • 学会等名: 第62回日本ウイルス学会学術集会
  • 発表場所: 横浜
  • 年月日: 2014-11-10 – 2014-11-12
• [学会発表] Prolactin regulatory element binding protein is involved in hepatitis C virus replication by interacting with NS4B. (2014)
  • 著者名/発表者名: Lingbao Kong、青柳春代、松田麻未、藤本陽、渡士幸一、鈴木亮介、山越智、堂前直、鈴木健裕、鈴木哲朗、脇田隆字、相崎英樹
  • 学会等名: 第62回日本ウイルス学会学術集会
  • 発表場所: 横浜
  • 年月日: 2014-11-10 – 2014-11-12
• [学会発表] 天然有機化合物 Neoechinulin B を利用した liver X receptor によるC 型肝炎ウイルス産生制御機構の解析 (2014)
  • 著者名/発表者名: 中嶋翔、渡士幸一、紙透伸治、竹本健二、Jesus Izaguirre-Carbonell、鈴木亮介、相崎英樹、菅原二三男、脇田隆字
  • 学会等名: 第62回日本ウイルス学会学術集会
  • 発表場所: 横浜
  • 年月日: 2014-11-10 – 2014-11-12
• [学会発表] 効率的な B 型肝炎ウイルス（HBV）複製評価系を用いた微小管依存的な HBV 複製機構の解析 (2014)
  • 著者名/発表者名: 岩本将士、渡士幸一、杉山真也、鈴木亮介、相崎英樹、田中靖人、溝上雅史、大谷直子、小祝修、脇田隆字
  • 学会等名: 第62回日本ウイルス学会学術集会
  • 発表場所: 横浜
  • 年月日: 2014-11-10 – 2014-11-12
• [学会発表] レチノイド阻害剤は NTCP 発現修飾を介して宿主細胞の B 型肝炎ウイルス感染感受性を消失させる (2014)
  • 著者名/発表者名: 九十田千子、渡士幸一、岩本将士、鈴木亮介、相崎英樹、小嶋聡一、杉山 真也、田中靖人、溝上雅史、脇田隆字
  • 学会等名: 第62回日本ウイルス学会学術集会
  • 発表場所: 横浜
  • 年月日: 2014-11-10 – 2014-11-12
• [学会発表] 遺伝子組換え酵母由来 B 型肝炎ウイルス様粒子の細胞表面への結合に関与する宿主因子の解析 (2014)
  • 著者名/発表者名: 松田麻未、鈴木亮介、嵯峨涼平、藤本陽、渡士幸一、相崎英樹、森石恆司、岡本 徹、松浦善治、黒田俊一、脇田隆字
  • 学会等名: 第62回日本ウイルス学会学術集会
  • 発表場所: 横浜
  • 年月日: 2014-11-10 – 2014-11-12
• [学会発表] B 型肝炎ウイルス（HBV）large S タンパク質と NTCP の相互作用阻害による抗 HBV 戦略 (2014)
  • 著者名/発表者名: 渡士幸一、Sluder Ann、松永智子、梁明秀、森下了、岩本将士、九十田千子、鈴木亮介、相崎英樹、Borroto-Esoda Katyna、田中靖人、楠原洋之、杉山真也、溝上雅史、脇田隆字
  • 学会等名: 第62回日本ウイルス学会学術集会
  • 発表場所: 横浜
  • 年月日: 2014-11-10 – 2014-11-12
• [学会発表] 日本脳炎ウイルスおよび C 型肝炎ウイルス 2 価ワクチン抗原の発現と中和抗体の誘導 (2014)
  • 著者名/発表者名: 嵯峨涼平、藤本陽、渡邉則幸、松田麻未、長谷川慎、渡士幸一、相崎英樹、中村紀子、小西英二、加藤孝宣、田島茂、高崎智彦、竹山春子、脇田隆字、鈴木亮介
  • 学会等名: 第62回日本ウイルス学会学術集会
  • 発表場所: 横浜
  • 年月日: 2014-11-10 – 2014-11-12
• [学会発表] Regulation of viral lifecycle in hepatitis C virus infection. (2014)
  • 著者名/発表者名: Wakita T, Kong L, Aizaki H. Regulation of viral lifecycle in hepatitis C virus infection.
  • 学会等名: Dynamic interplay between viruses and their hosts
  • 発表場所: パシフィコ横浜
  • 年月日: 2014-11-08 – 2014-11-09
• [学会発表] Japanese encephalitis virus-subviral particles harboring HCV neutralization epitopes induce neutralizing antibodies against HCV. (2014)
  • 著者名/発表者名: Saga R, Fujimoto A, Watanabe N, Matsuda M, Suzuki R, Hasegawa M, Watashi K, Aizaki H, Nakamura N, Konishi E, Kato T, Takeyama H, Wakita T.
  • 学会等名: 21st International Symposium on Hepatitis C Virus and Related Viruses
  • 発表場所: Banff (Canada)
  • 年月日: 2014-09-07 – 2014-09-11
• [学会発表] Single domain intrabodies against HCV core inhibit viral propagation and core-induced NF-kB activation. (2014)
  • 著者名/発表者名: Suzuki R, Saito K, Matsuda M, Sato M, Kanegae Y, Watashi K, Aizaki H, Chiba J, Saito I, Wakita T, Suzuki T.
  • 学会等名: 21st International Symposium on Hepatitis C Virus and Related Viruses
  • 発表場所: Banff (Canada)
  • 年月日: 2014-09-07 – 2014-09-11
• [学会発表] Identification of an important envelope region by competitive inhibition experiment with envelope peptides. (2014)
  • 著者名/発表者名: Watanabe N, Date T, Kono T, Aizaki H, Wakita T.
  • 学会等名: 21st International Symposium on Hepatitis C Virus and Related Viruses
  • 発表場所: Banff (Canada)
  • 年月日: 2014-09-07 – 2014-09-11
• [学会発表] Maintenance of HCV infectivity by down-regulating hepatic lipase expression. (2014)
  • 著者名/発表者名: Fujimoto A, Aizaki H, Matsuda M, Watanabe N, Watashi K, Suzuki R, Suzuki T, Wakita T.
  • 学会等名: 21st International Symposium on Hepatitis C Virus and Related Viruses
  • 発表場所: Banff (Canada)
  • 年月日: 2014-09-07 – 2014-09-11
• [学会発表] NS5A-associated membrane protein, embryonic lethal, abnormal vision, drosophila-like 1, regulates hepatitis C virus RNA synthesis and translation. (2014)
  • 著者名/発表者名: Goto K, Fujimoto A, Watashi K, Suzuki R, Yamagoe S, Moriya K, Yotsuyanagi H, Koike K, Suzuki T, Wakita T, Aizaki H.
  • 学会等名: 21st International Symposium on Hepatitis C Virus and Related Viruses
  • 発表場所: Banff (Canada)
  • 年月日: 2014-09-07 – 2014-09-11
• [学会発表] Flutamide Inhibits Hepatitis C Virus Assembly through Disrupting Lipid Droplets. (2014)
  • 著者名/発表者名: Ohashi H, Watashi K, Nakajima S, Kim S, Suzuki R, Aizaki H, Kamisuki S, Sugawara F, Wakita T.
  • 学会等名: 21st International Symposium on Hepatitis C Virus and Related Viruses
  • 発表場所: Banff (Canada)
  • 年月日: 2014-09-07 – 2014-09-11
• [学会発表] Regulation of hepatitis C virus replication by liver X receptor is disrupted by a fungi-derived neoechinulin B. (2014)
  • 著者名/発表者名: Nakajima S, Watashi K, Kamisuki S, Takemoto K, Suzuki R, Aizaki H, Sugawara F, Wakita T.
  • 学会等名: 21st International Symposium on Hepatitis C Virus and Related Viruses
  • 発表場所: Banff (Canada)
  • 年月日: 2014-09-07 – 2014-09-11
• [学会発表] Construction of novel infectious genotype 2b culture system. (2014)
  • 著者名/発表者名: Hmwe SS, Suda G, Sakamoto N, Imamura M, Hiraga N, Chayama K, Aizaki H, Wakita T.
  • 学会等名: 21st International Symposium on Hepatitis C Virus and Related Viruses
  • 発表場所: Banff (Canada)
  • 年月日: 2014-09-07 – 2014-09-11
• [学会発表] Characterization of a culture system reproducing the NTCP-mediated HBV entry and ITS application to drug development. 2014 International Meeting on Molecular Biology of Hepatitis B Viruses (2014)
  • 著者名/発表者名: Watashi K, Iwamoto M, Sluder A, Matsunaga S, Ryo A, Morishita R, Kwon ATJ, Suzuki H, Tsukuda S, Suzuki R, Aizaki H, Borroto-Esoda K, Sugiyama M, Tanaka Y, Mizokamai M, Wakita T.
  • 学会等名: International Meeting on the Molecular Biology of Hepatitis B Viruses
  • 発表場所: Los Angeles (USA)
  • 年月日: 2014-09-03 – 2014-09-06
• [学会発表] Microtubule-dependent hepatitis B virus (HBV) replication revealed by chemical screening on an efficient HBV-replicating cell line. (2014)
  • 著者名/発表者名: Iwamoto M, Watashi K, Sugiyama M, Suzuki R, Aizaki H, Tanaka Y, Mizokami M, Ohtani N, Koiwai O, Wakita T.
  • 学会等名: International Meeting on the Molecular Biology of Hepatitis B Viruses
  • 発表場所: Los Angeles (USA)
  • 年月日: 2014-09-03 – 2014-09-06
• [学会発表] Retinoid inhibitors abolish the host permissiveness to HBV infection by modulating NTCP expression. (2014)
  • 著者名/発表者名: Tsukuda S, Watashi K, Iwamoto M, Suzuki R, Aizaki H, Kojima S, Sugiyama M, Tanaka Y, Mizokami M, Wakita T.
  • 学会等名: International Meeting on the Molecular Biology of Hepatitis B Viruses
  • 発表場所: Los Angeles (USA)
  • 年月日: 2014-09-03 – 2014-09-06
• [学会発表] ヒトNTCP安定発現によるB型肝炎ウイルス(HBV)感染許容性の獲得とそれを用いたHBV侵入機構の解析 (2014)
  • 著者名/発表者名: 岩本将士、渡士幸一、九十田千子、Hussein Aly、藤本陽、鈴木亮介、相崎英樹、脇田隆字、深澤征義、小祝修、楠原洋之
  • 学会等名: 第22回肝病態生理研究会
  • 発表場所: 東京
  • 年月日: 2014-05-31 – 2014-05-31
• [学会発表] 培養系を用いた抗B型肝炎ウイルス化合物の同定と作用機序解析 (2014)
  • 著者名/発表者名: 渡士幸一、相崎英樹、脇田隆字
  • 学会等名: 第50回日本肝臓学会総会
  • 発表場所: 東京
  • 年月日: 2014-05-29 – 2014-05-30
• [学会発表] グリチルリチンによる抗C型肝炎ウイルス作用 - phospholipase A2およびAutophagyによるHCV分泌過程の制御 (2014)
  • 著者名/発表者名: 青柳東代、相崎英樹、松本喜弘、鈴木亮介、渡士幸一、市野瀬志津子、松浦知和、鈴木哲朗、和氣健二郎、脇田隆字
  • 学会等名: 第50回日本肝臓学会総会
  • 発表場所: 東京
  • 年月日: 2014-05-29 – 2014-05-30
• [学会発表] C型肝炎ウイルス生活環全体を標的とした新規作用を有する抗ウイルス剤の探索 (2014)
  • 著者名/発表者名: 脇田隆字、相崎英樹、渡士幸一
  • 学会等名: 第50回日本肝臓学会総会
  • 発表場所: 東京
  • 年月日: 2014-05-29 – 2014-05-30
• [学会発表] B型肝炎ウイルス(HBV)Lタンパク質とNTCPの相互作用阻害による抗HBV戦略 (2014)
  • 著者名/発表者名: 渡士幸一、Ann Sluder、松永智子、梁明秀、森下了、岩本将士、九十田千子、鈴木亮介、相崎英樹、Katyna Borroto-Esoda、田中靖人、楠原洋之、杉山真也、溝上雅史、脇田隆字
  • 学会等名: 第24回抗ウイルス療法研究会総会
  • 発表場所: 富士吉田
  • 年月日: 2014-05-07 – 2014-06-09
• [学会発表] グリチルリチンによる抗HCV作用 - phospholipase A2およびAutophagyによるC型肝炎ウイルス(HCV)分泌過程に与える影響 (2014)
  • 著者名/発表者名: 青柳東代、相崎英樹、藤本陽、松本喜弘、松田麻未、Su Su Hmwe、渡邉則幸、渡士幸一、鈴木亮介、市野瀬志津子、松浦知和、鈴木哲朗、和氣健二郎、脇田隆字
  • 学会等名: 第24回抗ウイルス療法研究会総会
  • 発表場所: 富士吉田
  • 年月日: 2014-05-07 – 2014-05-09
• [学会発表] C型肝炎ウイルス粒子の構築を阻害するflutamideの作用機序の解析 (2014)
  • 著者名/発表者名: 大橋啓史、渡士幸一、中嶋翔、金ソルイ、鈴木亮介、相崎英樹、紙透伸治、菅原二三男、脇田隆字
  • 学会等名: 第24回抗ウイルス療法研究会総会
  • 発表場所: 富士吉田
  • 年月日: 2014-05-07 – 2014-05-09
• [学会発表] HBV感染受容体NTCPの発現調節機構の解析およびこれを阻害する低分子化合物の抗HBV効果 (2014)
  • 著者名/発表者名: 九十田千子、渡士幸一、岩本将士、鈴木亮介、相崎英樹、小嶋聡一、脇田隆字
  • 学会等名: 第24回抗ウイルス療法研究会総会
  • 発表場所: 富士吉田
  • 年月日: 2014-05-07 – 2014-05-09
• [図書] HCV研究の最先端,HCV感染実験系における代謝変化. (2014)
  • 著者名/発表者名: 相崎英樹,松田麻未,藤本陽,脇田隆字.
  • 総ページ数: 4
  • 出版者: 日本メディカルセンター
• [備考] 国立感染症研究所ウイルス第二部
  • URL: http://www.nih.go.jp/niid/ja/vir2-hv.html