| 研究課題/領域番号 |
24591007
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
伊地知 秀明 東京大学, 医学部附属病院, 助教 (70463841)
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| 研究分担者 |
伊佐山 浩通 東京大学, 医学部附属病院, 講師 (70376458)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | 膵癌 / PSCA |
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| 研究概要 |
膵癌の発癌過程において早期から進行期までを通じ高発現している抗原PSCAは、膵癌の発癌機序の根幹にかかわっている可能性があると共に、治療標的であり、かつ早期診断にも用いることが出来る可能性がある。我々は、臨床の膵癌組織像をよく再現する遺伝子改変マウスモデル（膵臓上皮特異的変異型Kras発現＋Tgfbr2ノックアウト）を樹立し既に報告している。自験データでも、このマウス膵癌組織から樹立した膵癌細胞では、前癌病変の細胞（変異型Kras発現のみ）に比べ、PSCAは有意に高発現している。本研究では、このPSCA分子の機能解析を行うため、ヒト及びマウスの膵癌細胞においてPSCAの恒常的ノックダウン細胞株の樹立を試みた。複数のヒト・マウスの膵癌細胞株におけるPSCA発現をスクリーニングし、もともとPSCAを高発現しているヒト膵癌細胞株のPSCAを恒常的にノックダウンすると、in vitroにおける細胞増殖が著明に抑制され細胞死に至った。この結果から、PSCAの機能的重要性が示唆された。これと並行してPSCA発現ベクターをデザインし、ノックダウン株に強制発現をすることにより、細胞増殖の抑制がキャンセルされることを確認しようとした。十分なPSCA発現を達成できるウイルスベクターの樹立には時間を要した。今後これを用いてPSCAノックダウン株における細胞増殖抑制という表現型がoff target効果ではないことを確認し、PSCAノックダウンが惹起する遺伝子発現プロファイル変化をマイクロアレイにより網羅的に解析する。また、テトラサイクリン誘導性にPSCA発現をノックダウンするシステムを用いた細胞株の樹立も進めている。さらに、マウス膵癌細胞においてもPSCAノックダウン株を樹立し、C57BL/6野生型マウスに移植しin vivoにおけるPSCAの機能解析を今後行っていく予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
ヒトおよびマウス膵癌細胞を用いたPSCAの恒常的ノックダウン細胞を樹立し、その表現型の変化を見出すと共に、遺伝子発現プロファイルの変化を網羅的に解析し、PSCAの惹起する細胞内シグナルや標的分子を明らかにする計画であったが、PSCAという分子の扱いが容易ではなかったため、解析に用いるノックダウン細胞の樹立に時間を要した。ヒト膵癌細胞においては、mRNA発現量と蛋白発現量との乖離がよくみられた。これは、pseudogeneの存在のためと考えられた。またマウス細胞ではよいPSCA抗体がなく、蛋白量の制御を直接確認することが困難であった。ヒト膵癌細胞株で恒常的ノックダウン細胞を樹立できたが、増殖が著明に抑制され、その他の表現型を検討することが困難であった。またテトラサイクリン誘導性のPSCAノックダウンシステムの導入を試みたが、対照群となる細胞においてもテトラサイクリン誘導性に細胞死が生じてしまい、ノックダウン細胞との比較を進めることが困難であった。またPSCAを強制発現するウイルスベクターの作成も困難であった。これらのトラブルシューティングを行いながら研究を進め、ようやくPSCAノックダウンによる遺伝子発現プロファイル変化の網羅的解析の手前まで到達したところである。
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| 今後の研究の推進方策 |
まずヒト膵癌細胞PSCA恒常的ノックダウン株にPSCA発現ベクターを用いPSCA発現をレスキューすることで、in vitroの細胞増殖能が回復するかを確認し、これにより細胞増殖の著明な抑制という表現型が正にPSCAノックダウンによるものでありoff target効果ではないことの確証を得る。その上で、PSCAノックダウンによる膵癌細胞の遺伝子発現プロファイルの変化をマイクロアレイにて網羅的に解析する。この結果、有意に発現の変動した分子を定量的RT-PCRにて確認し、その中から細胞増殖抑制という表現型に関わっている標的分子を見出し、PSCA発現とその標的分子の発現との相関や細胞増殖との相関をin vitroの系にて検証する。その際、PSCAの強制発現系も用い、ノックダウンとは逆の発現制御の結果が得られるか、また細胞増殖促進効果がみられるか、についても検討する。
ここまでで得られたPSCA発現とそれに伴い変動する標的分子発現が、実際の臨床の膵癌組織や前癌病変のPanIN組織でもみられるか、手術検体の免疫染色にて検討する。
また、前年度までにテトラサイクリン依存的にPSCA発現をノックダウンできるマウス膵癌細胞株を樹立しており、この細胞をC57BL/6野生型マウスに移植し、テトラサイクリンによりノックダウンを誘導することでin vivoにおける癌細胞の増殖やアポトーシスに変化がみられるか、また脾注肝転移モデルにおいて肝転移の数やサイズに変化がみられるかといったin vivoにおける表現型の変化を検討する。
さらに、PSCA中和抗体による治療がin vivoモデルにおいて有効性を示すことができるか、そしてその作用機序について精査するために、このマウス膵癌細胞移植モデルと、膵臓特異的変異型Kras発現＋Tgfbr2ノックアウトによる膵発癌モデルを用いてPSCA中和抗体投与実験を行う。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
ヒト膵癌細胞PSCA恒常的ノックダウン株と対照株のin vitroにおける表現型の比較および遺伝子発現プロファイルの網羅的比較解析、その結果得られた発現の変化する分子についてのPSCA発現・表現型との相関を含めた機能解析、テトラサイクリン誘導性マウス膵癌細胞株PSCAノックダウン株と対照株のin vivoにおける表現型の比較、機能解析、臨床検体を用いた免疫組織学的検索、PSCA中和抗体による抗腫瘍効果の解析を行う。細胞培養関連に年間45万円、抗体その他の試薬類に年間80万円、マイクロアレイに25万円、動物飼育費用として30万円と試算した。
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