| 研究課題/領域番号 |
24591089
|
|---|
| 研究種目 |
基盤研究(C)
|
| 研究機関 | 弘前大学 |
|---|
研究代表者 |
長内 智宏 弘前大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (00169278)
|
|---|
| 研究分担者 |
奥村 謙 弘前大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (20185549)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2015-03-31
|
| キーワード | coupling factor 6 / intracellular acidosis / IF1 / mitochondria / prostacyclin / diabetes / hypertension / cardiac hypertrophy |
|---|
| 研究概要 |
1.Human ATPase inhibitory factor 1 (IF1) plasmid作成:Open Biosystems社のMHS1010-73732大腸菌を抗生物質入りLB培養液で培養し、Promega PureYeld Plasmid Midiprep System (Code No. A2495)を用いてhuman ATPase inhibitory factor 1 (IF1) plasmidを精製した。HEK293細胞にOpti-MEMI Reduced Serum MediumとTransIT-293 Reagentを用いてtransfectionし、anti-ATPase inhibitory factor 1 antibody (ab110277)を用いてWestern blot法で12kDに発現を確認した。2.IF1ペプチドの精製:上記で作成したhuman IF1 plasmidから制限酵素でmature human IF1 (26-106, 81aa)に相当する部分 (169-411) を切り出しpGEX-4T-3 Vectorに挿入した。E. coli BL21 (DE3)を用いて培養後、細菌ペレットをlysis buffereで溶解しGlutathion sepharose 4B カラムを通過させた。吸着物をthrombinで分解後HiTrap streptavidin HR columnでthrombinを除去し、human mature IF1を精製した。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
初年度はCF6の種々の作用（細胞内酸性化を介し、高血圧、内皮機能障害、糖尿病、左室肥大、血小板凝集亢進作用等）に対するIF1の拮抗作用を確認するための準備期間であり、IF1ペプチドの精製、IF1 plasmidの作成というもっとも重要な２過程が達成された。
|
| 今後の研究の推進方策 |
次年度からIF1の拮抗作用の有無について以下の検討を開始する。
IF1の細胞内情報伝達機構並びにATP産生に及ぼす影響
ヒト血管内皮細胞 (HUVEC) にIF1-cDNA (Open Biosystems, Invitrogen MHS1010-73732)をtransfectionしIF1を過剰発現、またはIF1ペプチドを投与し、CF6の細胞内情報伝達機構に及ぼす影響と細胞内ATP産生に及ぼす影響を明らかにする。
具体的には(1)ATP合成酵素は酸化的リン酸化によりATPを産生するので、CF6投与により水素イオンの移動を介して細胞内pHが変化する。細胞内pHのindicator であるBCECFをHUVEC内にloadし、CF6投与による細胞内pHの変化をIF1が阻害するかを蛍光装置を用いて明らかにする。また、(2)ATP産生を科学発光法を用いて測定する。
|
| 次年度の研究費の使用計画 |
該当なし
|
