| 研究課題/領域番号 |
24591104
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 久留米大学 |
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研究代表者 |
甲斐 久史 久留米大学, 医学部, 准教授 (60281531)
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| 研究分担者 |
打和 大幹 久留米大学, 医学部, 助教 (30624506)
梶本 英美 久留米大学, 循環器病研究所, 助教 (50349700)
青木 裕司 久留米大学, 医学部, 助教 (80597419)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | 高血圧 / 血圧変動 / 心臓リモデリング / 血管リモデリング |
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| 研究概要 |
本研究の目的は、血圧変動性増大が炎症を介して高血圧性臓器障害を助長する分子機序、特に「血圧変動」と「炎症」をリンクさせるkey moleculeを解明することである。具体的には、血圧変動性増大高血圧ラットでRac-PAK-MR系が活性化するか、RacおよびMR阻害薬が高血圧性臓器障害助長を抑制するかを確認することにある。さらに、心筋および血管特異的PAK欠失マウスを開発、血圧変動性増大高血圧モデルを作成し、PAK活性化と血圧変動性増大による高血圧性臓器障害助長に因果関係があることを証明する。
１．自然高血圧発症ラットSHRまたはWKY(正常血圧群)に両側圧受容体切離術SADを施行し、血圧安定正常血圧群（WKY+sham）、血圧変動性増大正常血圧群（WKY+SAD）、血圧安定高血圧群（SHR+sham）、血圧変動性増大高血圧群（HR+SAD）を作成。
２．テレメトリー法で平均血圧の標準偏差・変動係数により血圧変動性を定量的に評価。
３．心機能の評価：心エコー法にて、左室拡張・収縮期径、心室壁厚、左室内径短絡率(収縮能指標)、僧帽弁血流波形E波の減衰時間、E/A比(拡張能指標)を非観血的に経時的に測定。また、ミラーカテーテルを用いて収縮能評価(dP/dt)、拡張能指標(LVEDP、-dP/dT,τ)を観血的に測定。
４．組織学的・分子生物学的評価：左室重量/体重比、心筋細胞の最大横径、心筋線維化率にて心筋リモデリング・左室肥大を、心筋内血管の中膜厚、血管周囲線維化面積から血管リモデリングを評価。プルダウン法にて心筋Rac1活性を、ウエスタンブロット法にてリン酸化PAKを、免疫染色法にてＭＲ活性化を評価。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成24年度に、血圧変動性増大高血圧ラットモデルにおけるRac1-PAK1-MR系が活性化をwhole heartサンプルおよび免疫組織染色/蛍光免疫染色を用いて明らかにすることができた。しかしながら、当初予定していたレーザーマイクロダイセクション(LMD)法による細胞群特異的RNA抽出の収率が、最も興味深い浸潤細胞群と血管壁細胞群において予備実験で想定していたレベルより低く、特に浸潤細胞においてはジーンチップ解析には不十分な純度であった。そこで24年度にはレーザーマイクロダイセクション法の条件最適化に時間を要し同方法を用いた解析に遅れが生じた。そこで、まずwhole heartおよび免疫組織染色/蛍光免疫染色で得られた結果を先行して論文発表した。
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| 今後の研究の推進方策 |
１．平成２５年度の研究実施計画
血圧変動性増大高血圧ラットモデル実験で、浸潤細胞群・血管壁細胞群におけるLMD法の最適化を達成する。その結果に基づき心筋細胞、血管、浸潤細胞を分別し炎症・細胞増殖・細胞死・線維化などに関与する遺伝子発現を評価する。その後は当初の計画に従い、血圧変動性増大高血圧ラットモデルに対する特異的ALDO受容体阻害薬(SAB)および特異的Rac1阻害薬(NSC)の慢性投与を行う。SHR, SHR+SAD, SHR+SAB, SHR+NSC, SHR+SAD+SAB, SHR+SAD+NSCを作成。テレメトリー法を用いて、平均血圧、平均血圧の標準偏差・変動係数を算出し血圧変動性を定量評価。心エコー法・ミラーカテーテルにより心機能を評価。左室重量/体重比、心筋細胞横径、心筋線維化率から心筋リモデリングを評価。プルダウン法により心筋Rac1活性、ウエスタンブロット法によりリン酸化PAK、免疫染色法によりMR活性を評価。
２．平成２６年度の研究実施計画
血圧変動性増大高血圧マウスを慢性期1K1CマウスにSADを加えて確立。心筋特異的PAK欠失(PAK1-CM-KO)マウスを作成し、これを用いて血圧変動性増大高血圧PAK1-CM-KOマウスを作成。テレメトリー法により血圧変動性、心エコー法・ミラーカテーテルにより心機能、左室重量/体重比および心筋細胞横径、心筋線維化率から心筋リモデリングを評価。プルダウン法により心筋Rac1活性、ウエスタンブロット法によりリン酸化PAK、免疫染色法によりMR活性を評価。LMD法により心筋細胞、血管、浸潤細胞を分別した炎症・細胞増殖・細胞死・線維化などに関与する遺伝子発現を評価。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
平成24年度にLMD法による細胞群特異的RNA抽出の収率、純度に問題があったため、次年度には条件最適化を行う。そして心筋細胞、血管、浸潤細胞を分別し炎症・細胞増殖・細胞死・線維化などに関与する遺伝子発現を評価する。これらLMD法による遺伝子発現解析に研究費を用いる。
その後は当初の計画に従い、血圧変動性増大高血圧ラットモデルに対する特異的ALDO受容体阻害薬(SAB)および特異的Rac1阻害薬(NSC)の慢性投与を行う。SHR, SHR+SAD, SHR+SAB, SHR+NSC, SHR+SAD+SAB, SHR+SAD+NSCの作成、血圧測定用テレメトリー購入、血行動態測定用ミラーカテーテル購入、組織学的試薬、免疫染色およびウエスタンブロット法用の抗体および関連試薬購入のために研究費を用いる。
また、国際学会・国内学会での研究成果発表のための旅費、論文投稿料・別冊印刷費、文献複写料などを計上する。
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