研究課題
基盤研究(C)
(1)トランスジェニックマウスの作製神経細胞特異的に発現するプロモーターであるThy-1プロモーターを使用し，その下流にLoxP 配列で挟んだ赤色蛍光色素であるdsRed cDNA，さらにその下流に正常型TDP-43 cDNA を挿入したトランスジェニックマウスを作製した。トランスジェニックマウスの作製は北里大学医学部遺伝子高次機能解析センターの実験動物施設で行った。赤色蛍光色素の発現が確認できたトランスジェニックマウスラインに，理研より供与されたVAChT-Creトランスジェニックマウスを交配中である。VAChT-Creトランスジェニックマウスは，運動神経細胞特異的にCreが発現するマウスで，交配により運動神経細胞にTDP-43の発現が期待される。(2) アデノ随伴ウィルス（AAV1ウィルス）によるTDP-43/OPTN発現マウスの作製プラスミドベクターに正常型TDP43(WT-TDP43), 変異型TDP43（A315T-TDP43），正常型OPTN（WT-OPTN），変異型OPTN（E478G-OPTN）のcDNAを組み込んだ。遺伝子を組み込んだプラスミドベクターからAAV1ウィルスを作製した。精製したAAV1ウィルスをガラスマイクロピペットを用いて片側腰髄の前角に注入した。2週間後からマウスの脊髄組織を免疫染色し，運動神経細胞にTDP43/OPTN蛋白の発現を確認した。このTDP-43の過剰発現ではマウスの運動神経細胞死が起こり，一側下肢の麻痺が出現した。今後，麻痺の進展について観察し，組織学的検討を行う予定である。
2: おおむね順調に進展している
研究課題は筋萎縮性側索硬化症のモデル動物を(1)トランスジェニックマウスを用いて，(2)アデノ随伴ウィルスを用いて作製することである。トランスジェニックマウスはLoxP-Creシステムを用いており，Creマウスと交配後の発症を待っているところである。AAV1の注入による神経細胞への過剰発現モデルについてはすでにAAV1が作成完了で，予備実験では運動神経への発現が確認できている。今後は注入するマウスの数を増やし，経時変化を追う予定である。
トランスジェニックマウスはLoxP-Creシステムを用いており，Creマウスと交配後の発症を待ちながら，運動機能の測定，発症前の脊髄の組織学的検討を行う。AAV1の注入による神経細胞への過剰発現モデルについては注入による発現部位だけでなく，周囲の神経細胞（対側の腰髄など）への進展について蛋白・RNAレベルの解析を行う。
マウスを作製する段階は終了したため，これらのマウスを用いて組織学的検討および蛋白・RNAレベルの解析を行う。トランスジェニックマウスについては，発症前の運動神経細胞を用いて，AAV1注入モデルについては対側腰髄を用いてマイクロアレイを行う。
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北里医学
巻: 42(2) ページ: 85-93
J Neurosci
巻: 32(48) ページ: 17186-96
10.1523/JNEUROSCI.2220-12.2012
