研究課題
われわれは、PKA/AKAPシグナルに着目し、SPHAKPがインスリン分泌に及ぼす影響を検討した。始めに、real-time PCR法、ウエスタンブロット法および免疫染色法により、SPHKAPがマウスおよびラット膵β細胞に極めて特異的に発現することを確認した。ヒト膵島においてもβ細胞に特異的に発現していた。また、SPHKAPは、膵β細胞内では、インスリン分泌顆粒特的に局在していることを電子顕微鏡を用いた解析により明らかとした。免疫沈降法にでは、SPHKAPはPKA RIサブユニットに特異的に結合することを確認した。また、過去に報告されたラットSPHKAPの塩基配列に誤りがあることが判明し、ヒトおよびマウスSPHKAPにより相同性の高いcDNAをクローニングすることに成功した。そこで、ラット膵β細胞株であるINS-1D細胞に、ラットSPHKAP siRNAあるいはラットSPHKAP発現ベクターを感染させ、グルコース応答性およびエキセンディン-4促進性インスリン分泌への影響を検討したところ、SPHKAPは、両刺激によるインスリン分泌を抑制することが明らかとなった。さらに、SPHKAPがPKA活性を抑制し、その結果CREBなどの下流シグナルの活性化も抑制したことから、SPHKAPは、PKAを抑制的に調節してグルコース応答性およびインクレチン促進性インスリン分泌を抑制することが示された。上記から、SPHKAPがインスリン分泌顆粒に極めて多く発現しインスリン分泌を負に制御していることが示唆されたため、より詳細にSPHAKPの膵β細胞における役割を検討するため、SPHKAP-mCherryノックインマウスを作成することとした。現在、ホモマウスの作成に成功しており、SPHKAPの局在、インスリン分泌への影響、分子メカニズムの検討、その他表現系の変化について調査している。
2: おおむね順調に進展している
新規分子であるSPHKAPが膵β細胞に極めて特異的に発現することを明らかにでき、また、インスリン分泌に及ぼす影響を細胞レベルで確認することに成功した。その結果を踏まえ、より詳細なメカニズムを検討するために、SPHKAPのノックインマウスの作成に成功したことから、本研究は概ね順調に進展していると考える。
SPHKAPノックインマウスの作成に成功し、さらにホモマウスも誕生している。現在、交配を継続しており、ノックインマウスを用いた解析が十分に行える環境を整えている。ノックインマウスを用いた検討は、SPHKAP分子の組織および細胞内局在を明らかにすること、グルコース及びインクレチン応答性インスリン分泌への影響を確認すること、その他体重等の表現系を明らかにすること、インスリン分泌のみならずインクレチン分泌など他のホルモン分泌に影響を与える可能性はないかなど、行っていく予定である。
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