| 研究課題/領域番号 |
24591370
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 和歌山県立医科大学 |
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研究代表者 |
坂口 和成 和歌山県立医科大学, 先端医学研究所, 教授 (60178548)
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| 研究分担者 |
澤田 貴宏 和歌山県立医科大学, 先端医学研究所, 助教 (00382325)
三輪 英人 順天堂大学, 医学部, 准教授 (50231626)
古島 謙亮 和歌山県立医科大学, 医学部, 助教 (50392105)
京 雪楓 和歌山県立医科大学, 先端医学研究所, 講師 (70316123)
宮嶋 正康 和歌山県立医科大学, 共同利用施設, 助教 (80137257)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | 体格 |
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| 研究概要 |
Ephrin-EphA4系とGH-GHR系とのクロストーク接点の解明：EphA4がIGF1産生に関わる経路としてGH-GHR-Jak2系シグナルの修飾を介するものと、この経路によらないものの２種類に分けて研究を進めた。①EphA4の発現によるGHR/Jak2下流シグナルおよびIGF1 mRNA量への作用を調べるために、EphA4遺伝子(-/-)マウス由来線維芽細胞にretrovirusを使ってEphA4を発現させた。②Jak2発現の有無およびEphA4発現の増減によるIGF1産生シグナルへの作用を調べるために、Jak2遺伝子(-/-)マウス由来線維芽細胞にretrovirusを使い、Jak2およびEphA4を量を変えて発現させた。③上記①②の細胞を使って、リガンド刺激後のGHR, Jak2, Stat5bなどの分子の活性化を、免疫沈降（IP）による候補分子の免疫沈降（IP）、およびその後のチロシンリン酸化蛋白特異的抗体を使ってのウエスタンブロッティング（IB）により解析した。④上記③の研究と合わせて、特にEphA4との分子間結合を調べるために、GH-GHR系の各シグナル分子との共免疫沈降およびIBを実施した。⑤上記③の研究と合わせて、シグナルの最終点であるIGF1 転写への作用を調べるために、Real time PCR法を用いてIGF1 mRNAを定量する。⑥EphA4発現の有無の条件下で、IGF1刺激によるIGF1Rより下流のシグナルを調べるために、下流分子であるIRS1, MAPK, IP3-kinaseの活性化を、活性化分子特異的抗体を使用して解析した。
EphA4シグナルがIGF1産生および体格変化につながる組織の決定：臓器により、そのIGF1産生機序がGH依存性および非依存性と異なることが知られているため、臓器毎にCre-LoxP系を使ってEphA4を欠損させた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
Ephrin-EphA4系とGH-GHR系とのクロストーク接点の解明に関しては、完了し、既に出版している。後半のEphA4シグナルがIGF1産生および体格変化につながる組織の決定の部分に関しても、並行してマウスでのCre-LoxPによる遺伝子操作を実施してきたため、臓器特異的なEphA4KOマウスを作製できている。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまでは順調に成果を上げてきている。今後も当初の予定通り研究を進める。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
Cre-loxPシステムにより組織/細胞特異性EphA4ノックアウトマウスを作製してマウスの体格測定、組織内IGF1mRNA発現、血中IGF１値の測定などを実施し、コントロールマウスと比べる。EphA4 conditional alleleをもったマウス（EphA4 Flox マウス； Genesis 48:101-105, 2010）とalbumin-Cre、human alpha-skeletal actin-Cre、osteocalcin-Cre、GFAP-Cre、Col2a1-Creマウスなどを交配させることにより肝臓、横紋筋、血管内皮、脳細胞、軟骨細胞、骨芽細胞特異性のEphA4ノックアウトマウスを作製する。
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