| 研究課題/領域番号 |
24591422
|
|---|
| 研究機関 | 大阪大学 |
|---|
研究代表者 |
冨山 佳昭 大阪大学, 医学部附属病院, 准教授 (80252667)
|
|---|
| 研究分担者 |
柏木 浩和 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (10432535)
田所 誠司 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (80403062)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2015-03-31
|
| キーワード | インテグリンαIIbβ3 / 血小板 / タリン / キンドリン / Inside-out signaling / CMK細胞 |
|---|
| 研究実績の概要 |
インテグリンαIIbβ3(GPIIb-IIIa)は血小板機能の中核をなす蛋白であり、血小板と血小板の結合、すなわち血小板凝集に必要不可欠な接着蛋白である。世界の多くの研究者は、現在までαIIbβ3活性化機構を解析する有効な実験系が無いため、αIIbβ3を異所性に293T細胞やCHO細胞に発現させ機能解析しているが、これらの系で得られた成果が血小板にそのまま応用し得るかは疑問が多い。事実kindlin-3は血小板機能に必須であるがCHO細胞にはkindlin-3は発現しておらず、またCHO細胞に発現させたαIIbβ3は血小板と異なりアゴニスト刺激では活性化しない。
本研究では、αIIbβ3活性化機構の詳細を解析するために、新たにヒト巨核球系細胞株CMK細胞システムを開発した。CMK細胞システムはαIIbβ3がアゴニスト反応性に活性化する実験系であり、さらに新たにPAC1抗体を用いた短時間反応系のαIIbβ3活性化測定法も開発し、リアルタイムに近い形でαIIbβ3活性化を把握しうるように改善した。
RNAiと過剰発現を用いてtalin-1とkindlin-3の遺伝子改変を行いその影響を検討した。Talin-1およびkindlin-3をノックダウンするとαIIbβ3 の活性化は著しく障害された。THD、talin-1全長およびkindlin-3の過剰発現にてαIIbβ3 活性化は有意に増加したが、CHO細胞とは異なりCMK細胞ではTHD過剰発現のみではαIIbβ3は活性化せずアゴニスト刺激を必要とした。Talin-1の自己抑制を解除する変異体やβ3との結合部位変異などのtalin-1変異体およびレスキュー実験により、talin-1とkindlin-3の重要性と両者の相補的な役割が示唆された。特ににtalinのmembrane proximal regionとβ3の結合がαIIbβ3活性化において極めて重要であることが明らかになった。
|
