血友病Ａインヒビター制御を目的とした人工多能性幹細胞の応用

2012 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 24591430
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 研究機関: 自治医科大学
• 研究代表者: 窓岩 清治 自治医科大学, 医学部, 講師 (70296119)
• 研究分担者: 小林 英司 自治医科大学, 医学部, 研究員 (00245044) ; 大森 司 自治医科大学, 医学部, 講師 (70382843)
• 研究期間 (年度): 2012-04-01 – 2015-03-31
• キーワード: 血友病 / インヒビター / 免疫寛容 / 人工多能性幹細胞 / 遺伝子治療 / 細胞療法

研究概要

本研究は、血友病インヒビターの制御法の開発を主目的とし、インヒビター誘導第VIII因子欠損マウス（血友病Aマウス）を疾患モデルに用い、自己体細胞由来人工多能性幹細胞（iPS細胞）の細胞移植が第VIII因子抗原特異的な免疫寛容をもたらしインヒビターの発症を抑制する可能性とその制御機序を細胞レベルで探索するものである。１）血友病Aマウスから皮膚線維芽細胞を単離し、初期化４因子であるOct3/4、Klf4、Sox2、c-Myc遺伝子、およびc-Mycを除いた3因子の遺伝子の導入を行い、4因子誘導から30コロニー、3因子誘導から6コロニーを得ることができた。２）得られたコロニーを20継代以上培養し、ES様形態、ALP染色、SSEA-1発現、Nanog, Eras, Fbx15,Oct3/4 などのmRNAの発現を確認し、iPS細胞の検証を行った。３）SIVベクターに完全長ヒト第VIII因子cDNAとB domain deleted第VIII因子 cDNAを組み込むとともに、これらの5’側上流にCMVおよびEF-1alpha プロモーター、あるいはautoimmune regulator （AIRE）、cadherin 5、CD68などの細胞特異的プロモーターを配置したコンストラクトを作製した。さらにトレーサー実験を目的としたEGFPcDNAおよびluciferase cDNAを組み込んだコンストラクトを同時に構築し、これらすべてについてSIV化を終了させた。４）EF-1alphaプロモーターを用いることにより樹立した第VIII因子由来iPS細胞でEGFPの持続な高発現細胞が得られること、AIREプロモーターがマウス胸腺上皮細胞株IT-76MHC細胞（東北大学伊藤恒教授より供与）において特異的なluciferase活性が誘導されることが明らかとなった。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

当初の研究計画どおりに、血友病AマウスからのiPS細胞の樹立、遺伝子導入を目的とした完全長ヒト第VIII因子搭載SIVウイルスベクターの作製を終了し、次年度以降のin vitroおよびインヒビター誘導血友病Aマウスモデルを用いた研究へ展開する準備を完了したため。

今後の研究の推進方策

血友病Aインヒビター発症の予防と治療に繋げる新規方策を開発するため、血友病Aマウス個体における免疫応答の制御を目的に胸腺組織への選択的なiPS細胞移植法を具現化する。特にiPS細胞から胸腺上皮細胞への分化誘導系の検討、SIVベクターを用いたiPS細胞へのヒト完全長第VIII因子遺伝子導入法の確立、さらにヒト第VIII因子を発現する血友病Aマウス由来iPS細胞のマウス胸腺組織への細胞移植法に研究を展開する予定である。

次年度の研究費の使用計画

該当なし

研究成果

• [雑誌論文] Overexpression of factor VII ameliorates bleeding diathesis of factor VIII-deficient mice with inhibitors. (2013)
  • 著者名/発表者名: Yasumoto, A., S. Madoiwa, Y. Kashiwakura, A. Ishiwata, T. Ohmori, H. Mizukami, K. Ozawa, Y. Sakata and J. Mimuro
  • 雑誌名: Thromb Res. 巻: in press ページ: in press
  • DOI: 10.1016/j.thromres.2013.03.007
  • 査読あり
• [雑誌論文] Evaluation of hemostatic biomarker abnormalities that precede platelet count decline in critically ill patients with sepsis (2013)
  • 著者名/発表者名: Koyama, K., Madoiwa, S., Tanaka, S., Koinuma, T., Wada, M., Sakata, A., Ohmori, T., Mimuro, J., Nunomiya, S. and Sakata, Y.
  • 雑誌名: J Crit Care 巻: in press ページ: in press
  • DOI: 10.1016/j.jcrc.2012.10.069
  • 査読あり
• [雑誌論文] Minimizing the inhibitory effect of neutralizing antibody for efficient gene expression in the liver with adeno-associated virus 8 vectors (2013)
  • 著者名/発表者名: Mimuro, J., Mizukami, H., Hishikawa, S., Ikemoto, T., Ishiwata, A., Sakata, A., Ohmori, T., Madoiwa, S., Ono, F., Ozawa, K. and Sakata, Y.
  • 雑誌名: Mol Ther 巻: 21 ページ: 318-323
  • DOI: 10.1038/mt.2012.258
  • 査読あり
• [雑誌論文] Porcine model of hemophilia A (2012)
  • 著者名/発表者名: Kashiwakura, Y., Mimuro, J., Onishi, A., Iwamoto, M., Madoiwa, S., et al.
  • 雑誌名: PloS one 巻: 7 ページ: e49450
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0049450
  • 査読あり
• [雑誌論文] Tissue plasminogen activator deficiency promotes early phase regeneration in the olfactory epithelium after bulbectomy (2012)
  • 著者名/発表者名: Makino, N., Madoiwa, S., Ohmori, T., Katoh, K., Ookawara, S., Kanazawa, T., Matsuo, O., Ichikawa, M., Mimuro, J., Ichimura, K. and Sakata, Y.
  • 雑誌名: Int Forum Allergy Rhinol 巻: publised online ページ: publised on web
  • DOI: 10.1002/alr.21124
  • 査読あり
• [雑誌論文] Morphological assessment of the luminal surface of olfactory epithelium in mice deficient in tissue plasminogen activator following bulbectomy (2012)
  • 著者名/発表者名: Makino, N., Ookawara, S., Madoiwa, S., Ohta, Y., Ishikawa, T., Katoh, K., Takigami, S., Kanazawa, T., Matsuo, O., Ichikawa, M., Mimuro, J., Sakata, Y. and Ichimura, K.
  • 雑誌名: J Laryngol Otol 巻: 126 ページ: 1114-1120
  • DOI: 10.1017/S002221511200206X
  • 査読あり
• [雑誌論文] Acquired hemophilia A caused by factor VIII inhibitors: report of a case (2012)
  • 著者名/発表者名: Hosoya, Y., Matsumura, M., Madoiwa, S., Zuiki, T., Matsumoto, S., Nunomiya, S., Lefor, A., Sata, N. and Yasuda, Y.
  • 雑誌名: Surg Today 巻: published online ページ: publised on web
  • DOI: 10.1007/s00595-012-0290-x
  • 査読あり
• [雑誌論文] Intra-articular injection of mesenchymal stem cells expressing coagulation factor ameliorates hemophilic arthropathy in factor VIII-deficient mice (2012)
  • 著者名/発表者名: Kashiwakura, Y., Ohmori, T., Mimuro, J., Yasumoto, A., Ishiwata, A., Sakata, A., Madoiwa, S., Inoue, M., Hasegawa, M., Ozawa, K. and Sakata, Y.
  • 雑誌名: J Thromb Haemost 巻: 10 ページ: 1802-1813
  • DOI: 10.1111/j.1538-7836.2012.04851.x
  • 査読あり
• [雑誌論文] Il2rg gene-targeted severe combined immunodeficiency pigs (2012)
  • 著者名/発表者名: Suzuki S, Iwamoto M, Saito Y, Fuchimoto D, Sembon S, Suzuki M, Mikawa S, Hashimoto M, Aoki Y, Najima Y, Takagi S, Suzuki N, Suzuki E, Kubo M, Mimuro J, Kashiwakura Y, Madoiwa S, et al.
  • 雑誌名: Cell Stem Cell 巻: 10 ページ: 753-758
  • DOI: 10.1016/j.stem.2012.04.021
  • 査読あり
• [雑誌論文] FTY720 improves functional recovery after spinal cord injury by primarily nonimmunomodulatory mechanisms (2012)
  • 著者名/発表者名: Norimatsu, Y., Ohmori, T., Kimura, A., Madoiwa, S., Mimuro, J., Seichi, A., Yatomi, Y., Hoshino, Y. and Sakata, Y.
  • 雑誌名: Am J Pathol 巻: 180 ページ: 1625-1635
  • DOI: 10.1016/j.ajpath.2011.12.012
  • 査読あり
• [雑誌論文] Lack of association between serum paraoxonase-1 activity and residual platelet aggregation during dual anti-platelet therapy (2012)
  • 著者名/発表者名: Ohmori, T., Yano, Y., Sakata, A., Ikemoto, T., Shimpo, M., Madoiwa, S., Katsuki, T., Mimuro, J., Shimada, K., Kario, K. and Sakata, Y.
  • 雑誌名: Thromb Res 巻: 129 ページ: e36-40
  • DOI: 10.1016/j.thromres.2011.10.033
  • 査読あり
• [雑誌論文] Immune response against serial infusion of factor VIII antigen through an implantable venous-access device system in haemophilia A mice (2012)
  • 著者名/発表者名: Madoiwa, S., Kobayashi, E., Kashiwakura, Y., Sakata, A., Yasumoto, A., Ohmori, T., Mimuro, J. and Sakata, Y.
  • 雑誌名: Haemophilia 巻: 18 ページ: e323-330
  • DOI: 10.1111/j.1365-2516.2011.02686.x
  • 査読あり
• [学会発表] Regulation of plasminogen activator inhibitor-1 promotes immune tolerance to factor VIII in murine hemophilia A (2013)
  • 著者名/発表者名: Madoiwa S, Ohmori T, Kashiwakura Y, Sakata A, Mimuro J, Sakata Y
  • 学会等名: the XXIV Congress of the ISTH
  • 発表場所: Amsterdam, Netherland
  • 年月日: 20130703-20130703