ヒト未分化ＣＤ３４抗原陰性造血幹細胞の特性と分化経路・階層制の解明

2012 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 24591432
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 研究機関: 関西医科大学
• 研究代表者: 薗田 精昭 関西医科大学, 医学部, 教授 (60206688)
• 研究期間 (年度): 2012-04-01 – 2015-03-31
• キーワード: CD34 / SRC / HSC / MPL / IBMI

研究概要

今年度は、われわれが独自に開発した骨髄内直接移植(IBMI)法を用いて、ヒト臍帯血中に世界で初めて同定に成功した非常に未分化な造血幹細胞（HSC）であるCD34抗原陰性（CD34-）SCID-repopulating cell (SRC)（Blood 101:2924,2003）の更なる幹細胞特性の解明を行った。
本研究では、われわれが新たに開発した18種類のLineage (Lin)抗体を用いるnegative selection法（CD34-HSCを1/1,000の頻度まで高度に濃縮純化できる（Blood 114:336,2009; Exp Hematol 39:203,2011）を用いて標的細胞を純化した。本法で純化した18Lin-CD34-細胞におけるMPLの発現とその機能的意義について、18Lin-CD34+CD38-細胞を対照として詳細に検討した。
18Lin-CD34+/-分画におけるMPLの発現率は、各々42％、27％であった。CD34-MPL+細胞は、高い巨核球コロニー、赤血球＋巨核球混合コロニー形成能を示した。次に、限界希釈法で18Lin-CD34+/-MPL+/-分画におけるSRCの頻度を測定した。その結果、CD34+MPL+分画（1/48）、CD34+MPL-分画(1/146)、CD34-MPL+分画(1/580)、CD34-MPL-分画(1/1597)であった。これらの4分画細胞をNOGマウスにIBMI法で移植し、6か月毎に1,2,3次移植を行って長期ヒト造血再構築能について検討した。その結果、CD34+/-SRC共にMPLを発現していない分画で3次移植マウスの生着が認められた。
以上より、ヒト未分化HSC(SRC)のhierarchyは、CD34-MPL->CD34+MPL->CD34+MPL+> CD34-MPL+の順であることが示唆された。

現在までの達成度 (区分)

1: 当初の計画以上に進展している

理由

本年度の研究計画1）ヒト未分化HSCの陽性マーカーの同定と純化については、MPLの発現について詳細に検討した。その結果、ヒト未分化HSC(SRC)のhierarchyは、CD34-MPL->CD34+MPL->CD34+MPL+> CD34-MPL+の順であることが示唆された。以上より、MPLはヒト未分化CD34-HSC(SRC)の陽性マーカーというよりは、機能性マーカーであることが明らかになった（第54回米国血液学会発表、投稿準備中）。
並行して、18Lin-CD34-細胞分画における陽性分子マーカーについて網羅的な解析を行い、有望な分子マーカーを2つ（X, Y)同定した。ヒト臍帯血由来CD34+/-SRCは、すべてX+分画に認められ、18Lin-CD34-X+分画におけるCD34-SRCの頻度は約1/140であった。また、18Lin-CD34-X+Y+分画におけるCD34-SRCの頻度は、概算で1/10と推測され、18Lin抗体を用いるnegative selection法（CD34-SRCの頻度1/1000）に比較して、2つの陽性マーカーを用いることにより、約100倍の濃縮純化が可能になった（未発表）。
本年度の研究計画2）に関しては、ヒト骨髄より樹立したDP MSCを用いて、ヒト臍帯血由来18Lin-CD34-細胞との共培養系で、CD34+CD38-CD90+SRCが産生されることを明らかにしている。現在、平成25年度以降の研究計画に記載した本共培養系を用いるヒト未分化HSCの対外増幅システムの開発にすでに着手している。

今後の研究の推進方策

これまでの研究で、CD34-SRCの有望な陽性分子マーカー（X,Y）を同定した。そこで、この2つの陽性分子マーカーを用いて、CD34-SRCを高度に純化（頻度1/10）することが可能になった。そこで、18Lin-CD34-X+Y+分画を用いて、NOGマウスへの単一細胞移植を用いるヒト造血再構築系の開発、確立に取り組む。本系の確立により、1個のCD34-SRC(HSC)の幹細胞特性（自己複製能、多分化能、可塑性など）のさらなる解明やヒト未分化HSCのhierarchyの解明が進展するものと期待される。
また、高度に純化したHSC集団を用いるgene　chip解析により、HSCの維持・増幅に重要な新たな機能分子の発見・同定も可能になるものと期待される。
併せて、研究計画3）4）に記載したヒト未分化HSCにおけるCD34抗原のreversion、CD38抗原のreciprocalな発現、さらに、ヒト骨髄由来DPMSCを用いる共培養系によるヒト未分化HSCの体外増幅系の開発・確立に取り組む予定である。

次年度の研究費の使用計画

研究費は、主に、標的細胞の分離や培養、SRCの測定、解析に必要な試薬、培養器具、モノクローナル抗体、サイトカイン、NOGマウスなどを購入する物品費として使用する予定である。この他、国内の学会（日本血液学会など）の参加のための旅費として使用する予定である。

研究成果

• [学会発表] Biochemical analysis of human CD34+/-HSC-supporting mechanisms by human bone marrow-derived mesenchymal stromal cells. (2012)
  • 著者名/発表者名: Matsuoka Y, Sasaki Y, Takahashi M, Iwaki R, Nakatsuka R, Kohno H, Fujioka T, Sonoda Y.
  • 学会等名: The 10th Stem Cell Research Symposium
  • 発表場所: 淡路夢舞台（淡路市）
  • 年月日: 20120531-20120601
• [学会発表] ヒト造血幹細胞のhierarchyに関する新しいモデルの提唱
  • 著者名/発表者名: 薗田精昭
  • 学会等名: 第1回Kagawa Basic Research Forum
  • 発表場所: 高松商工会議所（高松市）
  • 招待講演
• [学会発表] マウス歯髄幹細胞によるヒト臍帯血由来未分化造血幹細胞支持能の解析
  • 著者名/発表者名: 中塚隆介、松岡由和、高橋雅也、岩城隆二、藤岡龍哉、佐々木豊、薗田精昭
  • 学会等名: 第20回近畿臍帯血幹細胞移植研究会
  • 発表場所: ホテルグランビア大阪（大阪市）
• [学会発表] Prospectively isolated PDGFRA and Sca-1 double positive dental pulp-derived mesenchymal stem cell-like cells have different characteristics as compared to PDGFRA and Sca-1 double positive bone marrow-derived mesenchymal stem cells.
  • 著者名/発表者名: Nakatsuka R, Uemura Y, Matsuoka Y, Takahashi M, Iwaki R, Fujioka T, Sasaki Y, Sonoda Y.
  • 学会等名: The 10th Annual Meeting of the International Society for Stem Cell Research
  • 発表場所: パシフィコ横浜（横浜市）
• [学会発表] Novel human bone marrow derived mesenchymal stromal cells lacking adipogenic differentiation potential support primitive human CD34-negative hematopoietic stem cells.
  • 著者名/発表者名: Matsuoka Y, Sasaki Y, Takahashi M, Iwaki R, Nakatsuka R, Kohno H, Fujioka T, Uemura Y, Asano H, Sonoda Y.
  • 学会等名: The 10th Annual Meeting of the International Society for Stem Cell Research
  • 発表場所: パシフィコ横浜（横浜市）
• [学会発表] マウス歯髄幹細胞と骨髄間葉系幹細胞の機能比較とヒト造血幹細胞のin vitro支持能の検討
  • 著者名/発表者名: 中塚隆介、松岡由和、高橋雅也、岩城隆二、藤岡龍哉、植村靖史、佐々木豊、薗田精昭
  • 学会等名: 第22回日本サイトメトリー学会総会
  • 発表場所: 千里ライフサイエンスセンター（豊中市）
• [学会発表] FACSにより予期的に分離されたマウスSca-1, PDGFRa陽性歯髄幹細胞は同一の表面免疫特性を持つ骨髄由来間葉系幹細胞とは異なる幹細胞特性を有する
  • 著者名/発表者名: 中塚隆介、植村靖史、薗田精昭
  • 学会等名: 第54回歯科基礎学会
  • 発表場所: 奥羽大学（郡山市）
• [学会発表] Human CD34-negative hematopoietic stem cells express potent erythroid/megakaryocytic potential.
  • 著者名/発表者名: Matsuoka Y, Takahashi M, Sasaki Y, Iwaki R, Nakatsuka R, Fujioka T, Kohno H, Sonoda Y.
  • 学会等名: The 74th Annual Meeting of the Japanese Society of Hematology
  • 発表場所: 国立京都国際会館（京都市）
• [学会発表] Functional significance of MPL expression in the human primitive hematopoietic stem cell compartment.
  • 著者名/発表者名: Takahashi M, Matsuoka Y, Iwaki R, Nakatsuka R, Fujioka T, Kohno H, Matsui K, Asano H, Sasaki Y, Kaneko K, Sonoda Y.
  • 学会等名: The 54th Annual Meeting of the American Society of Hematology
  • 発表場所: Atlanta (USA)
• [学会発表] Development of a highly efficient method for isolating very small embryonic-like stem cells identified in adult mouse and human bone and their stem cell characteristics.
  • 著者名/発表者名: Sonoda Y.
  • 学会等名: James Graham Brown Cancer Center Stem Cell Conference
  • 発表場所: Louisville (USA)
  • 招待講演
• [学会発表] ヒト臍帯血由来CD34抗原陰性造血幹/前駆細胞は高い巨核球/赤血球分化能を有する
  • 著者名/発表者名: 松岡由和、高橋雅也、岩城隆二、中塚隆介、藤岡龍哉、佐々木豊、薗田精昭
  • 学会等名: 第35回日本造血細胞移植学会総会
  • 発表場所: ANAクラウンプラザホテル（金沢市）
• [学会発表] マウス切歯由来Sca-1,PDGFRa陽性間葉系幹細胞のヒト臍帯血由来造血幹細胞支持能について
  • 著者名/発表者名: 中塚隆介、松岡由和、高橋雅也、岩城隆二、藤岡龍哉、佐々木豊、薗田精昭
  • 学会等名: 第35回日本造血細胞移植学会総会
  • 発表場所: ANAクラウンプラザホテル（金沢市）
• [学会発表] Functional significance of MPL expression in the human primitive hematopoietic stem cell compartment.
  • 著者名/発表者名: Takahashi M, Matsuoka Y, Nakatsuka R, Iwaki R, Kohno H, Fujioka T, Sasaki Y, Sonoda Y.
  • 学会等名: The 11th Stem Cell Research Symposium
  • 発表場所: Ito International Research Center (Tokyo)
• [図書] 臍帯血移植の基礎と臨床 (2013)
  • 著者名/発表者名: 薗田精昭
  • 総ページ数: 250
  • 出版者: 医学書院