ｉＰＳ細胞、及び疾患特異的ｉＰＳ細胞からの骨格筋細胞分化誘導に関する基盤研究開発

2012 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 24591508
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 加藤 竹雄 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (60422945)
• 研究期間 (年度): 2012-04-01 – 2015-03-31
• キーワード: 疾患特異的iPS細胞 / 骨格筋細胞

研究概要

当研究室において、これまでにES細胞から骨格筋への分化誘導培養の基盤研究をすすめており、マウスES細胞及びiPS細胞から、実験的に質のよい骨格筋線維を産生し、マウス骨格筋に有効に生着する前駆細胞を抽出する系を確立してきた（Mizuno Y et al. FASEB J 2010）。今回、この方法を応用させ、ヒトES細胞、ヒトiPS細胞から骨格筋細胞へ分化誘導する基盤技術の開発に取り組み、簡便な分化誘導系を用い、骨格筋選択的な分化誘導を行うことに成功し、論文発表を行った（Awaya T et al. PLOS ONE 2012）。本実験系では成熟骨格筋マーカーであるミオシン重鎖陽性細胞への分化誘導に成功し、また、骨格筋細胞への分化効率としてヒトES細胞、ヒトiPS細胞はともにほぼ同等な効率が得られ、また成熟骨格筋である多核筋繊維の形成も確認している。この実験系を用いて作成したヒトES細胞、ヒトiPS細胞由来の骨格筋細胞を免疫抑制マウス（NOGマウス）の筋障害モデルに移植することにより、マウス筋組織内に生着したこと確認した。また、移植したヒトES細胞、ヒトiPS細胞由来の骨格筋細胞は骨格筋の幹細胞と考えられている筋衛星細胞（PAX7陽性細胞）に組織内にて分化し、かつ、長期生着（少なくとも６ヶ月）を確認した。以上より、現時点で我々はヒトES細胞、ヒトiPS細胞から骨格筋細胞へ分化誘導する基盤技術を確立させ、この実験系によって分化誘導された骨格筋細胞は再生医療の手段、並びに筋疾患の病態解析のin vitroにおける実験的検証を行うことが可能であると考えている。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

我々はDuchenne型筋ジストロフィー（DMD）疾患特異的iPS細胞（DMD-iPS細胞）を８株所有している。iPS細胞の未分化能、多分化能のクオリティーを確認している。細胞株ごとにより細胞のクオリティーは多様性を示すことから、それぞれの細胞株のクオリティーの安定維持に時間を要している。

今後の研究の推進方策

正常iPS細胞から分化誘導した骨格筋細胞、骨格筋前駆細胞をコントロールとして、DMD-iPS細胞から分化誘導した骨格筋細胞、骨格筋前駆細胞における疾患特異的に発現しているタンパク質、RNA遺伝子を検出することによって、DMDの病態に関与する因子と、その作用機序について検討していくことを予定している。また、近年、DMDの治療として期待されている治療法の１つにエキソンスキッピング療法が注目されており、DMDモデル動物に対する治療効果について報告も多くされるようになっている。本システムがDMDの病態をin vitroで再現することが可能であることが確認されれば、本システムを用いて、DMDモデル動物において効果が示された治療のヒトにおける効果評価を安全に解析してきことも予定している。

次年度の研究費の使用計画

疾患特異的iPS細胞の骨格筋分化培養の実験系を確立させるため、培養用メディウム 250,000円、及び培養用プラスチック製品 250,000円を次年度の研究費として計上した。また、骨格筋細胞の分化誘導の効率化の向上を計る目的にて各種サイトカインが必要となり、平成25年度は培養システム確立のため300,000円必要となる。
免疫細胞組織染色を行なう上で、各種抗体の購入費用（平成25年度は200,000円）が必要とされ、RT-PCR解析を行なうために、RNA抽出キット、cDNA合成試薬、PCRプライマー等の費用（平成25年度は400,000円）が必要とされる。

研究成果

• [雑誌論文] Selective Development of Myogenic Mesenchymal Cells from Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells (2012)
  • 著者名/発表者名: Awaya Tomonari
  • 雑誌名: PLOS ONE 巻: 7 ページ: e51638
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0051638.
  • 査読あり
• [学会発表] Skeletal myogenesis from hES and hiPS cells. (2012)
  • 著者名/発表者名: Awaya, Tomonari
  • 学会等名: The 11th Annual Scientific Meeting of the Asian Oceanian Myology Center
  • 発表場所: Kyoto
  • 年月日: 20120606-20120608