研究課題
目的：遺伝子ノックアウトマウスを用いた、ポリコーム（PcG）遺伝子Rae28/Phc1、Pcgf5の機能解析を元に、心臓前駆細胞の分化・成熟過程に重要な、細胞増殖・分化の転換機構解明を目指し、更に、この転換機構の破綻がヒト先天性心疾患を生じさせ、PcG 遺伝子がその原因遺伝子である可能性について探索する。研究実績：1. Pcgf5遺伝子KOマウスの解析：個体レベルでPcgf5の機能解析を行うために、Pcgf5遺伝子KOマウスのヘテロ個体同士を交配し、ホモ個体を作出した。得られたホモ個体に大きな異常は確認されず、交配能力も維持されていたが、生後1年前後でほとんどのホモ個体が死亡した。生き残ったホモ個体を解析したところ、心不全症状を示し、Nppa、Myh7遺伝子の発現が大きく上昇していた。2. 免疫沈降法を用いたPcgf5をはじめとするPcGタンパク質と複合体を形成するタンパク質の探索：胎令9.5日、12.5日の心臓及びその周辺領域からタンパク質を抽出し、既に作製したPcgf5タンパク質、及び他のPcGタンパク質に対する抗体を用いて免疫沈降を行った。その結果、心臓発生に重要な転写因子である、Nkx2-5がPcGタンパク質と結合している可能性が示唆された。
3: やや遅れている
本研究について、一部を除いておおむね順調に進展している。1. 免疫沈降法を用いて、Pcgf5をはじめとするPcGタンパク質と複合体を形成するタンパク質の探索した結果、新たに心臓発生に重要な転写因子である、Nkx2-5がPcGタンパク質と結合している可能性が示唆された。2. Pcgf5遺伝子KOマウスを作製し、そのホモ個体において心臓発生に異常が生じると予想したが、実際には発生中のホモ個体胎仔に大きな異常は確認されず、生後約1年で心不全症状を示すことが確認された。生後個体の解析を行うため、Pcgf5遺伝子KOマウスの解析はやや遅れている。
1. Pcgf5遺伝子KOマウスの解析について：生後約1年前後のPcgf5遺伝子KOマウスのホモ個体の多くが、心不全症状を示して死亡すること明らかになった。今後、心不全症状を心エコー等を用いて詳細に解析するとともに、どのような原因で心不全を生じるのか、クロマチン免疫沈降（ChIP）法等を用いて標的遺伝子を同定し、その仕組みを明らかにする。2. Double KOマウスの作製について：Pcgf5遺伝子KOマウスはホモ個体において大きな異常が確認されていない。Pcgf5と同じファミリーを形成する他のPcgfタンパク質がその機能を補完している可能性を考え、既にPcgf5、Pcgf4/Bmi1 double KOマウスを作製するために交配を開始し、double heteroマウスを得ている。今後、double heteroマウス同士を交配し、発生中におけるPcgfタンパク質の機能について検討する。3. 免疫沈降法を用いたPcgf5をはじめとするPcGタンパク質と複合体を形成するタンパク質の探索：前年度の解析で、心臓発生に重要な転写因子である、Nkx2-5がPcGタンパク質と結合している可能性が示唆された。本年度はNkx2-5とPcGタンパク質の結合を免疫沈降法のみならず、免疫組織学的解析を用いて多方面から検討する。
注文していた試薬が、国内に在庫が無く海外発注となり、年度内に到着しなかったため。1. Pcgf5遺伝子KOマウスの解析について：引き続き、Pcgf5遺伝子KOマウスの解析を行う。どのような原因で心不全を生じるのか、クロマチン免疫沈降（ChIP）法等を用いて標的遺伝子を同定し、その仕組みを明らかにする。次年度に繰り越した研究費及び、本年度の研究費の一部は、本実験に使用する試薬、抗体の購入に使用する。2. 免疫沈降法を用いたPcgf5をはじめとするPcGタンパク質と複合体を形成するタンパク質の探索：Nkx2-5とPcGタンパク質の結合を免疫沈降法のみならず、免疫組織学的解析を用いて多方面から検討する。本解析に使用する抗体の購入、各試薬の購入に使用する。
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Mol Biol Cell
巻: 25 ページ: 1374-1383
10.1091/mbc.E13-09-0534
