ヒト多能性幹細胞を用いた脊索および神経管Ｆｌｏｏｒ ｐｌａｔｅの発生機序の解明

2013 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 24592124
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 森實 飛鳥 京都大学, iPS細胞研究所, 助教 (10528730)
• キーワード: 多能性幹細胞 / 脊索 / 神経 / 分化誘導

研究概要

研究の目的
1.ヒト多能性幹細胞(ES細胞:胚性幹細胞、iPS細胞:人工多能性幹細胞)から脊索細胞の誘導法を確立する。 2.同幹細胞由来の脊索細胞 、神経細胞を用いて神経管腹側のfloor plate型の細胞を誘導する。 3.Floor plateの発生で働く遺伝子、蛋白質のスクリーニングを 行う。 4.得られた知見によりより生体に近い環境でのドーパミン神経、運動神経の分化誘導法を確立し、再生医療や病態解明に役立 てる。
平成25年度の成果:前年度にある程度のプロトコールを確立したヒトES細胞、iPS細胞用からのmesendodermの誘導法に改良を加えた。添加する因子の濃度やタイミング、細胞の培養密度な どについて各段階で確認をながら変更を加えた。 また、複数のiPS細胞株を用いて、株間による誘導効率の差も検討した。また分化誘導については培地や添加物の組成に加えて、細胞の足場であるマトリックスが重要であると考えられる。最近、iPS細胞の未分化維持においてはフィーダー細胞を用いずに、ラミニン等の基質を使った培養を我々は行っている。そこで、脊索の分化誘導時に用いる培養器材表面のマトリックスの差についても検討した。具体的にはコラーゲンＩとラミニンを使った。その結果、コラーゲンＩコートを用いた方が各種脊索マーカーの発現が高かった。
Mesendodermからの第2段階の誘導では脊索誘導の指標としてNoto, Foxa2, Shh, Noggin, Chordin, Foxj1等を調べている。Shh, Foxa2の発現が確認されており、その発現量もプロトコールの変更に伴い、増加し、安定化をみることができた。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

多能性幹細胞の維持培養の技術の発展とともに、その分化誘導系も進展していく。我々は中内胚葉から脊索細胞への段階的な分化誘導を目指している。マウスのin vivoもしくはin vitroで得られた知識をもとにヒト細胞でも有用な分化誘導系の開発が進んでいる。

今後の研究の推進方策

マウスの胎児組織を用いて、脊索マーカーの検索を進めていく。

研究成果

• [雑誌論文] A novel efficient feeder-free culture system for the derivation of human induced pluripotent stem cells. (2014)
  • 著者名/発表者名: Masato Nakagawa, Yukimasa Taniguchi, Sho Senda, Nanako Takizawa, Tomoko Ichisaka, Kanako Asano, Asuka Morizane, Daisuke Doi, Jun Takahashi, Masatoshi Nishizawa, Yoshinori Yoshida, Taro Toyoda, Kenji Osafune, Kiyotoshi Sekiguchi and Shinya Yamanaka
  • 雑誌名: Sci Rep 巻: 4 ページ: 3594
  • DOI: 10.1038/srep03594
• [雑誌論文] Isolation of human induced pluripotent stem cell-derived dopaminergic progenitors by cell sorting for successful transplantation. (2014)
  • 著者名/発表者名: Daisuke Doi, Bumpei Samata, Mitsuko Katsukawa, Tetsuhiro Kikuchi, Asuka Morizane, Yuichi Ono, Kiyotoshi Sekiguchi, Masato Nakagawa, Malin Parmar and Jun Takahashi
  • 雑誌名: Stem Cell Reports 巻: 2 ページ: 337-50
  • DOI: 10.1016/j.stemcr.2014.01.013
  • 査読あり
• [雑誌論文] Neural induction with a dopaminergic phenotype from human pluripotent stem cells through a feeder-free floating aggregation culture. (2013)
  • 著者名/発表者名: Morizane A, Doi D, Takahashi J
  • 雑誌名: Methods Mol BioL 巻: 1018 ページ: 11-19
  • DOI: 10.1007/978-1-62703-444-9_2
• [雑誌論文] Differentiation-defective phenotypes revealed by large-scale analyses of human pluripotent stem cells. (2013)
  • 著者名/発表者名: Michiyo Koyanagi-Aoi, Mari Ohnuki, Kazutoshi Takahashi, Keisuke Okita, Hisashi Noma, Yuka Sawamura, Ito Teramoto, Megumi Narita, Yoshiko Sato, Tomoko Ichisaka, Naoki Amano, Akira Watanabe, Asuka Morizane, Yasuhiro Yamada, Tosiya Sato, Jun Takahashi and Shinya Yamanaka
  • 雑誌名: Proc Natl Acad Sci U S A 巻: 110 ページ: 20569-74
  • DOI: 10.1073/pnas.1319061110
  • 査読あり
• [雑誌論文] Direct Comparison of Autologous and Allogeneic Transplantation of iPSC-Derived Neural Cells in the Brain of a Nonhuman Primate (2013)
  • 著者名/発表者名: Asuka Morizane, Daisuke Doi, Tetsuhiro Kikuchi, Keisuke Okita, Akitsu Hotta, Toshiyuki Kawasaki, Takuya Hayashi, Hirotaka Onoe, Takashi Shiina, Shinya Yamanaka and Jun Takahashi
  • 雑誌名: Stem Cell Reports 巻: 1 ページ: 283-92
  • DOI: 10.1016/j.stemcr.2013.08.007
  • 査読あり
• [学会発表] 合成ラミニンを使用したiPS細胞からのドパミン神経分化誘導 (2014)
  • 著者名/発表者名: 森実飛鳥
  • 学会等名: 大阪大学蛋白研セミナー
  • 発表場所: 大阪
  • 年月日: 20140328-20140328
  • 招待講演
• [学会発表] iPS細胞由来ドパミン神経を用いた神経細胞の自家移植 (2014)
  • 著者名/発表者名: 森実飛鳥
  • 学会等名: 第９回京大病院iPS細胞・再生医学研究会
  • 発表場所: 京都
  • 年月日: 20140122-20140122
  • 招待講演
• [学会発表] Autologous Transplantation with iPSC-derived Neurons is Immunologically Beneficial even in the Brain (2014)
  • 著者名/発表者名: Asuka Morizane, Daisuke Doi, Tetsuhiro Kikuchi, Keisuke Okita, Akitsu Hotta, Toshiyuki Kawasaki, Hirotaka Onoe, Takashi Shiina , Shinya Yamanaka, and Jun Takahashi
  • 学会等名: The 7th Takeda Science Foundation Symposium on PharmaSciences,
  • 発表場所: Osaka, Japan
  • 年月日: 20140116-20140118
• [学会発表] Transplantation of autologous neural cells derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs) to the brain of non-human primate (2013)
  • 著者名/発表者名: Morizane A
  • 学会等名: 2013 CABX Workshop and International Symposium
  • 発表場所: Jeju, Korea
  • 年月日: 20131209-20131210
  • 招待講演
• [学会発表] Autologous Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons Causes Minimum Immune Reaction in the Brain of Non-Human Primate. (2013)
  • 著者名/発表者名: Morizane A, Doi D, Kikuchi T, Okita K, Hotta A, Kawasaki T, Onoe H, Shiina T, Takahashi J
  • 学会等名: ISSCR 11th Annual Meeting
  • 発表場所: Boston, USA
  • 年月日: 20130613-20130613