| 研究課題/領域番号 |
24592186
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 千葉大学 |
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研究代表者 |
村田 淳 千葉大学, 医学部附属病院, 准教授 (20344997)
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| 研究分担者 |
大河 昭彦 千葉大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (30312945)
山崎 正志 筑波大学, 医学医療系, 教授 (50281712)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | 神経障害性疼痛 / 坐骨神経結紮モデル / Noggin / アロジニア / Alzet pump / Western blot / BMP4 / くも膜下腔 |
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| 研究概要 |
【目的】今回の研究の目的は坐骨神経結紮によりNoggin 遺伝子が減少することがわかったが、タンパクレベルでの発現はどうか。減少したNoggin をくも膜下腔から投与し、アロディニアの改善が得られるかどうか。正常ラットにNoggin のアンタゴニストであるBMP4を投与することにより、アロディニアを惹起するかどうか。
【方法】Western blot： CCI後2週の時点で腰膨大部からタンパクを抽出。抗体は以下を使用した。正常ラットくも膜下腔へのBMP4投与： 正常ラットL3/4椎間に Alzet Pump （2週間用） を用いてRecombinant mouse BMP4 を投与、1週毎にｖon Frey testを行った。
CCIラットくも膜下腔へのNoggin 投与： CCI 2週後、同様にRecombinant mouse Noggin を投与、1週毎にｖon Frey testを行った。
【結果】Western blot：pSmad1, Noggin, BMP4について行った。Nogginのタンパクレベルでの減少はなく、BMP4の増加もなかった。
正常ラットくも膜下腔へのBMP4投与：PBS, BMP4投与、いずれもvon Frey testで5.46以上であり、 アロディニアを誘発しなかった。なおCCI１週後のデータは平均４．８８であった。 CCIラットくも膜下腔へのNoggin 投与：CCI後2週経過時点でNoggin をAlzet pump（2週用）にいれて、くも膜下腔にチューブを留置した。 Noggin濃度は１０nanoから１０microgram/mlまでとし、PBSをコントロールとした。 10nano, 2micro, 10microgram/ml でアロディニアの軽減がみられたので、3濃度について、Nを増やして実験を行っている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初予定していた、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔとＮｏｇｇｉｎタンパク、ＢＭＰ４タンパクのラットくも膜下腔投与に関しては順調に経過している。免疫染色に関しては、現在組織切片作成中であり、今後抗体を購入し実施する予定です。
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| 今後の研究の推進方策 |
今年度の研究でNogginタンパクをラット坐骨神経結紮モデルのくも膜下腔投与を行い、10nano, 2micro, 10microgram/ml でアロディニアの軽減がみられた。 今後同濃度についてＮを増やし、Nogginの最適濃度を決定する。さらにNoggin function blocking antibodyをNogginと一緒にくも膜下腔投与し、アロジニアの軽減がキャンセルされるかどうか検討する。Nogginがアロジニアの改善に効果があるようなら、組織学的検討を加える予定。
Noggin-function blocking antibodyが入手できない場合、坐骨神経結紮から2週後にNogginを投与していたものを、坐骨神経結紮直後よりNogginをAlzet pumpにて注入し、アロジニアの悪化が見られないかどうかを検討する。またその際のフレッシュな脊髄切片を作成し、Western blotにてNogginの増加が得られている、つまり脊髄にNogginが浸透していることを確認する予定。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
昨年度の研究でNogginタンパクをラット坐骨神経結紮モデルのくも膜下腔投与を行い、10nano, 2micro, 10microgram/ml でアロディニアの軽減がみられた。 今後３濃度についてＮを増やし、Nogginの最適濃度を決定する。さらにNoggin function blocking antibodyをNogginと一緒にくも膜下腔投与し、アロジニアの軽減がキャンセルされるかどうか検討する。これらの動物実験と試薬費用で50万円の支出を予定している。
Noggin-function blocking antibodyが入手できない場合、坐骨神経結紮直後よりNogginをAlzet pumpにて注入し、アロジニアの悪化が見られないかどうかを検討する。またその際のフレッシュな脊髄切片を作成し、Western blotにてNogginの増加が得られている、つまり脊髄にNogginが浸透していることを確認する予定。これらの費用でおよそ50万円の支出を予定している。
H24年度に未使用額が発生した原因として、上記のNoggin-function blocking antibodyが商業ベースの企業から入手できなかったことがあげられ、H25年度には上記のように投与時期を早めたNogginの投与実験の実験計画を考えている。
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