| 研究課題/領域番号 |
24592270
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 大分大学 |
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研究代表者 |
松尾 哲孝 大分大学, 医学部, 准教授 (10284788)
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| 研究分担者 |
吉岡 秀克 大分大学, 医学部, 教授 (00222430)
佐々木 隆子 大分大学, 医学部, 助教 (30133193)
岡本 修 大分大学, 医学部, 講師 (40284799)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | 軟骨 / 転写 / コラーゲン |
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| 研究概要 |
まず、XXVII型コラーゲン遺伝子の選択的プロモーターの軟骨細胞に特異的な基本転写調節機構を検討するために、長さの異なるルシフェラーゼコンストラクトを作製し、プロモーター活性を検討した。その結果、２つの基本プロモーター領域が明らかとなった。
次に、これら２つの基本プロモーター領域に関与する転写調節領域を絞り込むために、長さの異なるルシフェラーゼコンストラクトを作製して検討した。その結果、下流のプロモーターは、約１００bpの転写調節領域が、上流のプロモーター領域には約１５０bpの転写調節領域が存在した。そこで、これら２つの転写調節領域に関与する転写因子を同定するために、ゲルシフトアッセイ用のプローブを作製した。
更に、XI型およびXXVII型コラーゲン遺伝子の軟骨特異的エンハンサー領域についても、その活性領域を明らかにするために、ルシフェラーゼコンストラクトを作製し、軟骨および骨細胞を用いて、活性を比較検討した。その結果、軟骨特異的なシスエレメントについて、約２００bpの領域まで絞り込むことができた。そこで、これら２つの軟骨特異的調節領域に関与する転写因子を同定するために、ゲルシフトアッセイ用のプローブを作製した。
加えて、これら組織特異的エンハンサー活性の生体内での機能を調べるために、GFPおよびβガラクトシダーぜのコンストラクトを作製した。同時に、受精卵へのインジェクションも試み始めている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
掲げた研究計画のうち、XXVII型コラーゲン遺伝子の選択的プロモーターの基本転写調節機構については、順調に解析が進んでいる。同様に、XI型およびXXVII型コラーゲン遺伝子の軟骨特異的エンハンサー領域についても、ほぼその活性領域が明らかになりつつある。この２つの遺伝子の生体内での発現を確認するための、GFPおよびβガラクトシダーぜのコンストラクトも作製済であり、受精卵へのインジェクションも試み始めている。
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| 今後の研究の推進方策 |
引き続き、プロモーターおよびエンハンサー活性に関わる転写因子の同定を試みる。同時に、個体での機能を明らかにするために、トランスジェニックマウスの作製も試みる。更に、マイクロRNAによる制御機構につても、検討を開始する予定である。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
基本的には、細胞培養、動物、生化学および分子生物学的手法に関わる消耗品として使用する。関与する転写因子が明らかになった場合は、その機能を検討するために、siRNAや強制発現用のベクター等の購入にも使用する。また現在、軟骨細胞への導入効率があまりよくないので、改善策を検討しているが、その１つとしてエレクトロポレーション等の機器導入も考えている。
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