| 研究課題/領域番号 |
24592488
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 日本医科大学 |
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研究代表者 |
桑原 慶充 日本医科大学, 医学部, 講師 (40373013)
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| 研究分担者 |
片山 映 日本医科大学, 医学部, 助教 (10333113)
中井 章人 日本医科大学, 医学部, 教授 (20227721)
川端 伊久乃 日本医科大学, 医学部, 助教 (20328793)
竹下 俊行 日本医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (60188175)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | 頸管リモデリング / プロゲステロン |
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| 研究概要 |
1. 子宮頸管リモデリングに特異的な分子動態を誘導した子宮繊維芽細胞初代培養系の確立に向けて、非妊娠時（良性婦人科疾患による子宮摘出前）および陣痛発来前（予定帝王切開時）に子宮頸部組織の生検・採取について、倫理委員会の承認を得た。
2.プロゲステロンのジェノミック作用解析の予備実験として、卵巣ステロイドホルモン受容体を有するヒト高分化型腺癌細胞Ishikawaを、卵巣ステロイド非添加(Cont)、エストラジオール添加(E: 10nM beta-Estradiol)、エストラジオール+プロゲステロン添加(E+P: 10nM beta-Estradiol+10μM Progesterone)にてそれぞれ培養し、抽出タンパクを蛍光色素で標識し二次元電気泳動に展開した。さらに、画像解析ソフト（Progenesis）を用いてマッチングし、蛍光強度による比較定量で1.4倍以上に統計的有意な発現変化を示した蛋白スポットを質量分析装置で同定した。発現変化は① Cont<E<E+P, ②Cont<E>E+P, ③ Cont=E<E+P, ④ Cont<E=E+P, ⑤Cont>E<E+P, ⑥Cont>E>E+P の6つに分類され,これらの分子動態はプロゲステロンのノンジェノミック作用を反映している可能性が示唆された。
3.プロゲステロンのノンジェノミック作用解析の予備実験としてマウス卵巣顆粒膜細胞の初代培養モデルを用いて、特異的リン酸化抗体を用いたウェスタンブロッティングによるシグナル解析を行った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
臨床検体の使用に関する学内倫理委員会の承認に時間を要した。その間に、既に確立された培養モデルを用いた予備実験を行った。
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| 今後の研究の推進方策 |
1. 臨床検体より採取し継代培養した子宮繊維芽細胞初代培養系にLPS を添加し、頸管リモデリング特異的分子動態誘導モデルの確立を行う。
2. プロゲステロン添加/非添加の条件で培養し、抽出タンパクを可溶化し蛍光色素で標識する。二次元電気泳動へ展開し質量分析器を用いてプロゲステロン添加により特異的動態を示す分子群の同定を行う。
3.プロゲステロン添加/非添加の条件で培養し、抽出タンパクをリン酸化特異的抗体を用いたイムノブロッティングを行い、プロゲステロンがノンジェノミックに作用するシグナル伝達経路を明らかとする。
4.同定された標的分子、シグナル伝達経路をターゲットとした機能解析へと展開する
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| 次年度の研究費の使用計画 |
二次元電気泳動装置、質量分析器(Bruker: イオントラップ型 amaZon ETD, Qtof型maXi)、リアルタイムPCR分析装置（7500 FAST, 7900FAST/Applied Biosystems製）、DNAシーケンサー、遠心器、CO2 インキュベーター、蛍光顕微鏡、分光光度計、検体処理およびタンパク質精製に必要な設備はすべて整っている。したがって、細胞培養関連試薬、電気泳動用試薬、遺伝子解析試薬、抗体等の消耗品の購入を行う。
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