| 研究課題/領域番号 |
24592594
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 浜松医科大学 |
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研究代表者 |
峯田 周幸 浜松医科大学, 医学部, 教授 (40190714)
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| 研究分担者 |
三澤 清 浜松医科大学, 医学部附属病院, 講師 (90334979)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | 網羅的メチル化解析 / 頭頸部癌 / 5-Azacytidine / 次世代シークエンサー |
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| 研究概要 |
頭頸部癌におけるゲノム網羅的なエピジェネティック解析という研究テーマで、研究を遂行している。近年、DNAのメチル化を始めとするエピジェネティックな変化が、RNA合成、ひいてはタンパク質の発現を抑制することから、癌化機構の一つとして認識されている。最近、ゲノム全体のメチル化状態を明らかにするメチル化DNA解析は、次世代シークエンサーの登場で網羅性と解像度に大きな向上がみられている。特にゲノム網羅的エピゲノム解析法の登場で、いままで困難であった網羅性を実現することができるようになっている。
本年度は、ゲノム網羅的エピゲノム解析のためのサンプルの作成を行った。喉頭癌細胞株（Hep-2）を5-Azacytidine（脱メチル化剤を）による治療を行った。5-Azacytidineを5uMの濃度で7日間治療を行うのがHep-2細胞株に対しては効率的に脱メチル化を起こすことを確認している。7日間の治療を5回ほど行いそれぞれの治療でmRNA、 DNAをおのおの抽出してeEF1A2, GALR1, SALL3遺伝子のmRNAの再発現とDNA脱メチル化をPCR法にて確認している。また、細胞株の実験終了後に臨床検体を使った次世代シークエンシングを行う予定で、手術症例からの正常部と癌部のサンプリングを継続的に行っている。来年度は、実際に次世代シークエンシングを広島大学にておこなう予定である。データー解析も広島大学で行う予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度は、ゲノム網羅的エピゲノム解析のためのサンプルの作成に成功した。喉頭癌細胞株（Hep-2）を5-Azacytidine（脱メチル化剤を）による治療を行った。5-Azacytidineを5uMの濃度で7日間治療を行うのがHep-2細胞株に対しては効率的に脱メチル化を起こすことを確認している。7日間の治療を5回ほど行いそれぞれの治療でmRNA、 DNAをおのおの抽出してeEF1A2, GALR1, SALL3遺伝子のmRNAの再発現とDNA脱メチル化をPCR法にて確認している。また、細胞株の実験終了後に臨床検体を使った次世代シークエンシングを行う予定で、手術症例からの正常部と癌部のサンプリングを継続的に行っている。
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| 今後の研究の推進方策 |
初年度の実験計画はおおむね予定通りに進んでいる。来年度は、実際に広島大学にてシークエンシングを行う予定である。細胞株からのデーターを確認・解析をしながら臨床検体のシークエンスを行う予定である。癌幹細胞関連マーカーの発現との比較などおこなう。予算の限り多検体を解析しデーターの蓄積を行っていきたい。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
来年度は、次世代シーケンサー用のサンプル調整を行う。精製されたメチル化DNA断片の両端に、シーケンスに必要なアダプター配列を付加する作業を、サンプル調整(sample prep)と称する。NEB社 cat.#E6040Sのサンプル調整キットを使用する。メチル化DNA 10ngをスタート材料とし、まずEnd repair反応を行い、DNA断片の両断端を平滑末端化する。Klenow fragmentを用い、平滑末端化したDNA断端にdAを付加する。Adaptor Oligo mix(シーケンスに必要なアダプター配列)をligationする。アダプターを付加したメチル化DNAをゲル電気泳動し、300bp付近を切り出す。アダプター配列をプライマーとしたPCRをかけ、メチル化DNAに対応した配列を増幅する。PCR後のDNA量とサイズを測定し、サンプル調整は終了となる。これを持って、広島大学にてシークエンシングを行う予定である。
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