ヒトｉＰＳ技術を用いた網膜色素変性症に対する新規神経保護治療の開発に向けた研究

2012 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 24592647
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 研究機関: 慶應義塾大学
• 研究代表者: 小澤 洋子 慶應義塾大学, 医学部, 講師 (90265885)
• 研究期間 (年度): 2012-04-01 – 2015-03-31
• キーワード: 網膜 / 幹細胞 / iPS / 再生 / 神経保護

研究概要

網膜色素変性症は、遺伝子異常を原因とし、徐々に進行する疾患で、失明原因の上位を占める。早期に診断が付いても進行を抑制する安定した治療法はないのが現状である。異常遺伝子が明らかになっていても、網膜神経細胞障害（死）のメカニズムは今のところ、わかっていないものが多いためである。その理由の一つが、患者網膜を採取して、培養したり解析したりすることが困難であることである。そこで、患者の異常遺伝子を持つ人工多能性細胞(induced-pluripotent stem cell; iPS細胞)を用いて病態メカニズムを解析し、新規の神経保護治療法の開発に向けた研究を開始した。
具体的には、網膜色素変性症患者の皮膚細胞由来のiPS細胞を樹立し、これを網膜細胞に分化誘導した。そして、視細胞をはじめとした網膜細胞に安定した分化誘導が得られるようになった。この網膜細胞は、患者遺伝子異常を保持した細胞であり、これを用いて細胞死のメカニズムを解析することで、上述のこれまでの研究上の問題点を解消する可能性があった。我々は次に、この網膜細胞の中で視細胞だけに注目して解析を行うために、視細胞のみを標識する方法を樹立した。すなわち、視細胞特異的に発現するNRL遺伝子のプロモーター支配下にGFPを発現するベクターを、分化誘導中の細胞にウイルスを用いて感染させ、標識することに成功した。このベクターを発現している細胞はGFPを指標にフローサイトメトリーを用いて選択的に回収することが可能であった。現在はこの細胞を回収してその性質を分子レベルで解析している。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

ヒトiPS細胞の培養には、時間とコストがかかることが知られるが、研究は概ね予定通り達成中である。

今後の研究の推進方策

患者皮膚細胞由来のiPS細胞を網膜細胞に分化誘導し、さらに視細胞を標識したうえで、その視細胞の細胞死のメカニズムを解析する。遺伝子異常により異常タンパクが蓄積すると、小胞体ストレスを生じさらに酸化ストレスが惹起されることが予想されるため、まずはこれに注目して解析する。細胞内シグナル伝達機構等の観点から解析し、将来的に、その視細胞死のメカニズムを解消するための創薬につながる研究を行う。
今後は、標識した視細胞における酸化ストレスマーカーの解析を行う。そのためにジヒドロエチジウム・DCF-DAなどの色素による活性酸素種の検出を行う。すでに申請者はその方法を確立し、発表した論文にもデータを載せた（Sasaki Ozawa et al. Diabetologia 2010）。
また、標識した視細胞はフローサイトメトリーを用いて選択的に回収することとする。既に当大学施設内にあるフローサイトメトリーを利用する許可は得てあり、予備実験ののち、視細胞回収の実験を開始する。得られたサンプルを用いて、小胞体ストレスのマーカーであるIre1、CHOP、Bipなどの分子を免疫細胞染色および分子生物学的手法で検出する。これらの手法は習得済である。必要な抗体およびリアルタイムRT-PCRプライマーは、既に一部入手済みで他の物も手配中である。

次年度の研究費の使用計画

予定通りiPS細胞の培養に必要な試薬、器具、およびその解析に必要な免疫細胞学的試薬や分子生物学的試薬等の購入、資料収集と成果報告のための旅費等に充てることとする。

研究成果

• [雑誌論文] Detection of Early Visual Impairment in Patients with Epiretinal Membrane. (2013)
  • 著者名/発表者名: Nishi Y, Shinoda H, Uchida A, Koto T, Mochimaru H, Nagai N, Tsubota K, Ozawa Y.
  • 雑誌名: Acta Ophthalmologica. 巻: 91 ページ: e353-e357
  • DOI: 10.1111/aos.12060.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Renin-angiotensin system involvement in the oxidative stress-induced neurodegeneration of cultured retinal ganglion cells. (2013)
  • 著者名/発表者名: Ozawa Y, Yuki K, Yamagishi R, Tsubota K, Aihara M.
  • 雑誌名: Jpn J Ophthalmol. 巻: 57 ページ: 126-32
  • DOI: 10.1007/s10384-012-0204-x.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Serum vascular adhesion protein-1 correlates with vascular endothelial growth factor in patients with type II diabetes. (2013)
  • 著者名/発表者名: Yoshikawa N, Noda K, Shinoda H, Uchida A, Ozawa Y, Tsubota K, Mashima Y, Ishida S.
  • 雑誌名: J Diabetes Complications. 巻: 27 ページ: 162-6
  • DOI: 10.1016/j.jdiacomp.2012.09.001.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Presence and physiological function of Renin-Angiotensin System in mouse lacrimal gland. (2012)
  • 著者名/発表者名: Yaguchi S, Ogawa Y, Shimmura S, Hatou S, Nakamura S, Inaba T, Imada T, Ozawa Y, Kawakami Y, Ishida S, Tsubota K.
  • 雑誌名: Invest Ophthalmol Vis Sci. 巻: 53 ページ: 5416-25
  • DOI: 10.1167/iovs.12-9891.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Photo-damage mechanisms and anti-apoptotic effect of lutein in the mouse retina. (2012)
  • 著者名/発表者名: Miyake S, Sasaki M, Takahashi N, Tsubota K, Ozawa Y.
  • 雑誌名: Inflammation and Regeneration. 巻: 32 ページ: 208-12
  • 査読あり
• [雑誌論文] Soluble Vascular Adhesion Protein-1 Accumulates in Proliferative Diabetic Retinopathy. (2012)
  • 著者名/発表者名: Murata M, Noda K, Fukuhara J, Kanda A, Kase S, Saito W, Ozawa Y, Mochizuki S, Kimura S, Mashima Y, Okada Y, Ishida S.
  • 雑誌名: Invest Ophthalmol Vis Sci. 巻: 53 ページ: 4055-62
  • DOI: 10.1167/iovs.12-9857.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Blockade of vascular adhesion protein-1 attenuates choroidal neovascularization. (2012)
  • 著者名/発表者名: Yoshikawa N, Noda K, Ozawa Y, Tsubota K, Mashima Y, Ishida S.
  • 雑誌名: Mol Vis. 巻: 18 ページ: 593-600
  • 査読あり
• [雑誌論文] The formation of an angiogenic astrocyte template is regulated by the neuroretina in a HIF-1-dependent manner. (2012)
  • 著者名/発表者名: Nakamura-Ishizu A, Kurihara T, Okuno Y, Ozawa Y, Kishi K, Goda N, Tsubota K, Okano H, Suda T, Kubota Y.
  • 雑誌名: Dev Biol. 巻: 363 ページ: 106-114
  • DOI: 10.1016/j.ydbio.2011.12.027.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Vision preservation during retinal inflammation by anthocyanin-rich bilberry extract: cellular and molecular mechanism. (2012)
  • 著者名/発表者名: Miyake S, Takahashi N, Sasaki M, Kobayashi S, Tsubota K, Ozawa Y.
  • 雑誌名: Lab Invest. 巻: 92 ページ: 102-9
  • DOI: 10.1038/labinvest.2011.132.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Biological role of lutein in the light-induced retinal degeneration. (2012)
  • 著者名/発表者名: Sasaki M, Yuki K, Kurihara T, Miyake S, Noda K, Kobayashi S, Ishida S, Tsubota K, Ozawa Y.
  • 雑誌名: J Nutr Biochem. 巻: 23 ページ: 423-9
  • DOI: 10.1016/j.jnutbio.2011.01.006.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Use of micronutrient supplement for preventing advanced Age-related Macular Degeneration in Japan. (2012)
  • 著者名/発表者名: Sasaki M, Shinoda H, Koto T, Uchida A, Tsubota K, Ozawa Y.
  • 雑誌名: Archives of Ophthalmology 巻: 130 ページ: 254-5
  • DOI: 10.1001/archopthalmol.2011.1368.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Acute visual field defect following vitrectomy determined to originate from optic nerve by electrophysiological tests. (2012)
  • 著者名/発表者名: Uchida A, Shinoda K, Matsumoto C.S, Kawai M, Kawai S, Ohde H, Ozawa Y, Ishida S, Inoue M, Mizota A, Tsubota K.
  • 雑誌名: Case Rep Ophthalmol. 巻: 3 ページ: 396-405
  • DOI: 10.1159/000345507.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Neuroprotective Effects of Lutein in the Retina. (2012)
  • 著者名/発表者名: Ozawa Y, Sasaki M, Takahashi N, Kamoshita M, Miyake S, Tsubota K.
  • 雑誌名: Current Pharmaceutical Design. 巻: 18 ページ: 51-6
  • DOI: 10.2174/138161212798919101
  • 査読あり
• [学会発表] iPS細胞を用いた網膜色素変性症における視細胞の変性機構の解析 (2013)
  • 著者名/発表者名: 吉田哲、小沢洋子、鈴木啓一郎、平林由香、鈴木禎史、小泉春菜、結城賢弥、小林哲郎、大山学、天谷雅行、岡田洋平、赤松和土、松崎有未、三谷幸之介、榛村重人、坪田一男、岡野栄之
  • 学会等名: 第12回 日本再生医療学会
  • 発表場所: 神奈川県横浜市
  • 年月日: 20130321-20130323
• [学会発表] An analysis of the mechanisms of degradation of photoreceptor cells in a retinitis pigmentosa patient using iPS cells. (2012)
  • 著者名/発表者名: Yoshida T, Ozawa Y, Suzuki K, Hirabayashi Y, Suzuki S, Koizumi H, Yuki K, Kobayashi T, Ohyama M, Amagai M, Okada Y, Akamatsu W, Matsuzaki Y, Mitani K, Shimmra S, Tsubota K, Okano H.
  • 学会等名: Global COE Final Symposium .Center for Integrated Medical Research,
  • 発表場所: 東京都新宿区
  • 年月日: 20121203-20121204
• [学会発表] An analysis of the mechanisms of degradation of photoreceptor cells in a retinitis pigmentosa patient using iPS cells. (2012)
  • 著者名/発表者名: Yoshida T, Ozawa Y, Hirabayashi Y, Suzuki K, Mitani K, Kobayashi T, Ohyama M, Amagai M, Okada Y, Akamatsu W, Tsubota K, Shimmura S, Okano H.
  • 学会等名: International Society for Stem Cell Research (ISSCR) 10th annual meeting,
  • 発表場所: 神奈川県横浜市
  • 年月日: 20120613-20120616