ヒトｉＰＳ技術を用いた網膜色素変性症に対する新規神経保護治療の開発に向けた研究

2013 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 24592647
• 研究機関: 慶應義塾大学
• 研究代表者: 小澤 洋子 慶應義塾大学, 医学部, 講師 (90265885)
• キーワード: 網膜 / 幹細胞 / iPS / 再生 / 神経保護

研究概要

網膜色素変性症は、遺伝子異常を原因とし、徐々に進行する疾患で、失明原因の上位を占める。早期に診断が付いても進行を抑制する安定した治療法はないのが現状である。異常遺伝子が明らかになっていても、網膜神経細胞障害（死）のメカニズムは今のところ、わかっていないものが多いためである。その理由の一つが、患者網膜を採取して、培養したり解析したりすることが困難であることである。そこで、患者の異常遺伝子を持つ人工多能性細胞(induced-pluripotent stem cell; iPS細胞)を用いて病態メカニズムを解析し、新規の神経保護治療法の開発に向けた研究を開始した。
具体的には、網膜色素変性症患者の皮膚細胞由来のiPS細胞を樹立し、これを網膜細胞に分化誘導した。また、コントロールiPS細胞からも網膜細胞を分化誘導した。我々は次に、この網膜細胞の中で視細胞だけに注目して解析を行うために、視細胞のみを標識する方法を樹立した。すなわち、視細胞特異的に発現するNRL遺伝子のプロモーター支配下にGFPを発現するベクターを、分化誘導中の細胞にウイルスを用いて感染させ、標識することに成功した。このベクターを発現している細胞はGFPを指標にフローサイトメトリーを用いて選択的に回収することが可能であり、iPS細胞から分化誘導し視細胞数を計測したり、遺伝子発現を定量的に解析することが可能となる。患者由来iPS細胞から、もしくはコントロールiPS細胞から誘導した視細胞を比べることで，その背景にあるメカニズムを解析する。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

ヒトiPS細胞の培養には、時間とコストがかかることが知られるが、分化誘導や分子機構の解析は概ね予定通り達成中である。

今後の研究の推進方策

患者皮膚細胞由来のiPS細胞を網膜細胞に分化誘導して標識した視細胞を回収し、視細胞の細胞死のメカニズムを解析する。遺伝子異常により異常タンパクが蓄積すると、小胞体ストレスを生じさらに酸化ストレスが惹起されることが予想されるため、まずはこれに注目して解析する。細胞内シグナル伝達機構等の観点から解析し、将来的に、その視細胞死のメカニズムを解消するための創薬につながる研究を行う。
標識した視細胞はフローサイトメトリーを用いて選択的に回収する。既に当大学施設内にあるフローサイトメトリーしサンプルを回収する実験を開始した。得られたサンプルを用いて、小胞体ストレスのマーカーであるIre1、CHOP、Bipなどの分子を免疫細胞染色および分子生物学的手法で検出する。これらの手法は習得済である。必要な抗体およびリアルタイムRT-PCRプライマーは、既に一部入手済みで他の物も手配中である。

次年度の研究費の使用計画

未使用額の発生は、効率的な物品調達を行った結果である。
iPS細胞の培養に必要な試薬、器具、およびその解析に必要な免疫細胞学的試薬や分子生物学的試薬等の購入、資料収集と成果報告のための旅費等に充てることとする。

研究成果

• [雑誌論文] Angiotensin II type 1 receptor blockade suppresses light-induced neural damage in the mouse retina. (2014)
  • 著者名/発表者名: Narimatsu T, Ozawa Y, Miyake S, Nagai N, Tsubota K.
  • 雑誌名: Free Radical Biol Med. 巻: [Epub ahead of print] ページ: 1-10
  • DOI: 10.1016/j.freeradbiomed
  • 査読あり
• [雑誌論文] Phase II enzyme induction by a carotenoid, lutein, in a PC12D neuronal cell line. (2014)
  • 著者名/発表者名: Miyake S, Kobayashi S, Tsubota K, Ozawa Y
  • 雑誌名: Biochem Biophys Res Commun. 巻: 446 ページ: 535-540
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2014.02.135.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Association of Serum Lipids with Macular Thickness and Volume in Type 2 Diabetes without Diabetic Macular Edema. (2014)
  • 著者名/発表者名: Sasaki M, Kawashima M, Kawasaki R, Uchida A, Koto T, Shinoda H, Tsubota K, Jie Jin Wang, Ozawa Y.
  • 雑誌名: Invest Ophthalmol Vis Sci. 巻: 55 ページ: 1749-1753
  • DOI: 10.1167/iovs.13-13035.
• [雑誌論文] Vitrectomy for myopic foveoschisis with internal limiting membrane peeling and no gas tamponade. (2014)
  • 著者名/発表者名: Uchida A, Shinoda H, Koto T, Mochimaru H, Nagai N, Tsubota K, Ozawa Y.
  • 雑誌名: Retina. 巻: 34 ページ: 455-460
  • DOI: 10.1097/IAE.0b013e3182a0e477.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Atp6ap2/(pro)renin receptor interacts with Par3 as a cell polarity determinant required for laminar formation during retinal development in mice. (2013)
  • 著者名/発表者名: Kanda A, Noda K, Yuki K, Ozawa Y, Furukawa T, Ichihara A, Ishida S
  • 雑誌名: J Neurosci. 巻: 33 ページ: 19341-19351
  • DOI: 10.1523/JNEUROSCI.1362-13.2013.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Biological effects of blocking blue and other visible light on the mouse retina. (2013)
  • 著者名/発表者名: Narimatsu T, Ozawa Y, Miyake S, Kubota S, Yuki K, Nagai N, Tsubota K.
  • 雑誌名: Clinical & Experimental Ophthalmology. 巻: [Epub ahead of print] ページ: 1-9
  • DOI: 10.1111/ceo.12253.
  • 査読あり
• [雑誌論文] ABCA4 Gene Screening by Next-Generation Sequencing in a British Cohort. (2013)
  • 著者名/発表者名: Fujinami K, Zernant J, Chana RK, Wright GA, Tsunoda K, Ozawa Y, Tsubota K, Webster AR, Robson AG. Moore AT, Allikmets R, Michaelides M.
  • 雑誌名: Invest Ophthalmol Vis Sci. 巻: 54 ページ: 6662-6674
  • DOI: 10.1167/iovs.13-12570.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Neuroprotective Role of VEGF Induced in Response to Photodynamic Therapy. (2013)
  • 著者名/発表者名: Ozawa Y, Suzuki M, Niikura N, Kamoshita M, Nagai N, Tsubota K
  • 雑誌名: Advances in Neuroimmune Biology 巻: 4 ページ: 161-165
  • DOI: 10.3233/NIB-130062
  • 査読あり
• [雑誌論文] The Association between Visual Field Defect Severity and Fear of Falling in Primary Open-Angle Glaucoma. (2013)
  • 著者名/発表者名: Yuki K, Tanabe S, Kouyama K, Fukagawa K, Uchino M, Shimoyama M, Ozeki N, Shiba D, Ozawa Y, Abe T, Tsubota K.
  • 雑誌名: Invest Ophthalmol Vis Sci. 巻: 54 ページ: 7739-7745
  • DOI: 10.1167/iovs.13-12079.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Angiotensin II Type 1 Receptor Antagonist Attenuates Lacrimal Gland, Lung, and Liver Fibrosis in a Murine Model of Chronic Graft-Versus-Host Disease. (2013)
  • 著者名/発表者名: Yaguchi S, Ogawa Y, Shimmura S, Kawakita T, Hatou S, Satofuka S, Nakamura S, Imada T, Miyashita H, Yoshida S, Yaguchi T, Ozawa Y, Mori T, Tsubota K.
  • 雑誌名: PLoS ONE. 巻: 8 ページ: e64724
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0064724.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Calorie restriction (CR) and CR mimetics for the prevention and treatment of age-related eye disorders. (2013)
  • 著者名/発表者名: Kawashima M, Ozawa Y, Shinmura K, Inaba T, Nakamura S, Kawakita T, Watanabe M, Tsubota K.
  • 雑誌名: Exp Gerontol. 巻: 48 ページ: 1096-1100
  • DOI: 10.1016/j.exger.2013.04.002.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Blockade for Vascular Adsion Protein-1 Suppresses Pathological Neovascularization in Oxygen-Induced Retinopathy. (2013)
  • 著者名/発表者名: Yoshikawa N, Noda K, Ozawa Y, Mashima Y, Ishida S.
  • 雑誌名: Acta Ophthalmologica. 巻: 91 ページ: e409-e410.
  • DOI: 10.1111/aos.12128.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Light-dark condition regulates sirtuin mRNA levels in the retina. (2013)
  • 著者名/発表者名: Ban N, Ozawa Y, Inaba T, Miyake S, Watanabe M, Shinmura K, Tsubota K.
  • 雑誌名: Exp Gerontol. 巻: 48 ページ: 1212-1217
  • DOI: 10.1016/j.exger.2013.04.010.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Disruption of cell-cell junctions and induction of pathological cytokines in the retinal pigment epithelium of light-exposed mice. (2013)
  • 著者名/発表者名: Narimatsu T, Ozawa Y, Miyake S, Kubota S, Hirasawa M, Nagai N, Shimmura S, Tsubota K.
  • 雑誌名: Invest Ophthalmol Vis Sci. 巻: 54 ページ: 4555-4562
  • DOI: 10.1167/iovs.12-11572.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Molecular Characteristics of Four Japanese Cases with KCNV2-retinopathy: Report of Novel Disease-causing Variants. (2013)
  • 著者名/発表者名: Fujinami K, Tsunoda K, Nakamura N, Kato Y, Noda T, Shinoda K, Tomita K, Hatase T, Usui T, Akahori M, Itabashi T, Iwata T, Ozawa Y, Tsubota K, Miyake Y.
  • 雑誌名: Molecular Vision. 巻: 19 ページ: 1580-1590.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Neuroinflammation and Neurodegenerative Disorders of the Retina. (2013)
  • 著者名/発表者名: Ozawa Y, Kamoshita M, Narimatsu T, Ban N, Toda E, Okamoto T, Yuki K, Miyake S Tsubota K
  • 雑誌名: Endocrinology & Metabolic Syndrome. 巻: 2 ページ: 1-4
  • DOI: 10.4172/2161-1017.1000111
  • 査読あり
• [雑誌論文] Neuroprotective Role of Superoxide Dismutase 1 in Retinal Ganglion Cells and Inner Nuclear layer Cells against N-methyl-D-aspartate-induced cytotoxicity. (2013)
  • 著者名/発表者名: Yuki K, Yoshida T, Seiji M, Tsubota K, Ozawa Y
  • 雑誌名: Exp Eye Res. 巻: 115 ページ: 230-238
  • DOI: 10.1016/j.exer.2013.07.002.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Detection of Early Visual Impairment in Patients with Epiretinal Membrane. (2013)
  • 著者名/発表者名: Nishi Y, Shinoda H, Uchida A, Koto T, Mochimaru H, Nagai N, Tsubota K, Ozawa Y.
  • 雑誌名: Acta Ophthalmologica. 巻: 91 ページ: e353-e357
  • DOI: 10.1111/aos.12060.
  • 査読あり
• [学会発表] Evaluation of functional visual acuity in advanced age-related macular degeneration with good visual acuity. (2013)
  • 著者名/発表者名: Tomita Y, Nagai N, Suzuki M, Sasaki M, Tsubota K, Ozawa Y
  • 学会等名: Asia Pacific Vitreo-retina Society Congress
  • 発表場所: 名古屋国際会議場 (愛知県名古屋市)
  • 年月日: 20131205-20131207
• [学会発表] 狭義加齢黄斑変性に対するpro re nateによるラニビズマブ硝子体注射. (2013)
  • 著者名/発表者名: 鈴木美砂, 永井紀博, 永井香奈子, 篠田肇, 内田敦郎, 厚東隆志, 持丸博史, 富田洋平, 佐々木真理子, 坪田一男, 小沢洋子.
  • 学会等名: 第67回日本臨床眼科学会
  • 発表場所: パシフィコ横浜 (神奈川県横浜市)
  • 年月日: 20131031-20131103
• [学会発表] 抗VEGF療法に反応不良の滲出型加齢黄斑変性に対するアフリベルセプトの作用． (2013)
  • 著者名/発表者名: 永井紀博，永井香奈子，鈴木美砂，持丸博史，富田洋平，内田敦郎，佐々木真理子，篠田肇，坪田一男，小沢洋子
  • 学会等名: 第67回日本臨床眼科学会
  • 発表場所: パシフィコ横浜 (神奈川県横浜市)
  • 年月日: 20131031-20131103
• [学会発表] Disruption of cell-cell junctions and induction of pathological cytokines in the retinal pigment epithelium of light-exposed mice. (2013)
  • 著者名/発表者名: Ozawa Y
  • 学会等名: INTERNATIONAL RETINA SUMMIT
  • 発表場所: Hong Kong
  • 年月日: 20131019-20131019
  • 招待講演
• [学会発表] Disruption of cell-cell junctions and induction of pathological cytokines in the retinal pigment epithelium of light-exposed mice. (2013)
  • 著者名/発表者名: Ozawa Y,Narimatsu T, Kazuo T.
  • 学会等名: 1st International Symposium of Blue Light Society
  • 発表場所: JP TOWER Hall & Conference , Marunouchi, Chiyoda-ku, Tokyo
  • 年月日: 20130606-20130608
  • 招待講演
• [学会発表] Biological effects of blocking blue and over visible light on the mouse retina. (2013)
  • 著者名/発表者名: Narimatsu T, Ozawa Y, Miyake S, Kubota S, Yuki K, Nagai N, Tsubota K.
  • 学会等名: 1st International Symposium of Blue Light Society
  • 発表場所: JP TOWER Hall & Conference , Marunouchi, Chiyoda-ku, Tokyo
  • 年月日: 20130606-20130608
• [学会発表] AMPK-NF-kB axis modulates visual function during inflammation. (2013)
  • 著者名/発表者名: Kamoshita M, Kubota S, Yuki K, Miyake S, Nagai N, Umezawa K, Tsubota K, Ozawa Y.
  • 学会等名: Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) Annual Meeting
  • 発表場所: Washington State Convention & Trade Center Seattle
  • 年月日: 20130509-20130509
• [学会発表] Disruption of cell-cell junctions and induction of pathological cytokines in the retinal pigment epithelium of light-exposed mice. (2013)
  • 著者名/発表者名: Narimatsu T, Ozawa Y, Miyake S, Kubota S, Hirasawa M, Nagai N, Shimmura S, Tsubota K.
  • 学会等名: Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) Annual Meeting
  • 発表場所: Washington State Convention & Trade Center Seattle
  • 年月日: 20130509-20130509
• [学会発表] Baseline characteristics and response to intravitreal ranibizumab therapy for age-related macular degeneration. (2013)
  • 著者名/発表者名: Suzuki M, Nagai N, Izumi-Nagai K, Shinoda H, Koto T, Uchida A, Mochimaru H, Yuki K, Tsubota K, Ozawa Y
  • 学会等名: Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) Annual Meeting
  • 発表場所: Washington State Convention & Trade Center Seattle
  • 年月日: 20130508-20130508
• [学会発表] Light-dark Condition Regulates Sirtuin Genes in the Retina. (2013)
  • 著者名/発表者名: Ban N, Inaba T, Miyake S, Tsubota K, Ozawa Y.
  • 学会等名: Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) Annual Meeting
  • 発表場所: Washington State Convention & Trade Center Seattle
  • 年月日: 20130507-20130507
• [学会発表] Associations of Serum Lipids with Macular Morphology in Patients without Diabetic Macular Edema. (2013)
  • 著者名/発表者名: Sasaki M, Kawashima M, Kawasaki R, Kawai M, Uchida A, Koto T, Mochimaru H, Shinoda H, Jie Jin Wang, Tsubota K, Ozawa Y.
  • 学会等名: Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) Annual Meeting
  • 発表場所: Washington State Convention & Trade Center Seattle
  • 年月日: 20130506-20130506
• [学会発表] Involvement of Angiopoietin-like 2 in Laser-induced Choroidal Neovascularization. (2013)
  • 著者名/発表者名: Hirasawa M, Endo M, Kamoshita M, Miyake S, Narimatsu T, Nagai N, Tsubota K, Ozawa Y
  • 学会等名: Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) Annual Meeting
  • 発表場所: Washington State Convention & Trade Center Seattle
  • 年月日: 20130505-20130505
• [学会発表] Renin-Angiotensin System (RAS) involvement in the Oxidative Stress-Induced Impairment of Retinal Neuronal Cells. (2013)
  • 著者名/発表者名: Ozawa Y
  • 学会等名: 3rd International Conference on Clinical & Experimental Ophthalmology,
  • 発表場所: Chicago/Northbrook, USA
  • 年月日: 20130415-20130417
  • 招待講演
• [学会発表] 脈絡膜新生血管モデルにおける Angiopoietin-like 2の関与 (2013)
  • 著者名/発表者名: 平沢学, 遠藤元誉, 鴨下衛, 成松俊雄, 三宅誠司, 永井紀博, 坪田一男, 尾池雄一, 小沢洋子
  • 学会等名: 第117回 日本眼科学会総会
  • 発表場所: 東京国際フォーラム (東京都千代田区)
  • 年月日: 20130404-20130407
• [学会発表] AMP活性化プロテインキナーゼによる抗炎症作用と視機能維持 (2013)
  • 著者名/発表者名: 鴨下衛, 久保田俊介, 三宅誠司, 結城賢弥, 永井紀博, 梅澤一夫, 坪田一男, 小沢洋子.
  • 学会等名: 第117回 日本眼科学会総会
  • 発表場所: 東京国際フォーラム (東京都千代田区)
  • 年月日: 20130404-20130407
• [学会発表] AMP活性化プロテインキナーゼ経路を介した実験的脈絡膜新生血管の抑制 (2013)
  • 著者名/発表者名: 永井紀博，久保田俊介，坪田一男，小澤洋子
  • 学会等名: 第117回 日本眼科学会総会
  • 発表場所: 東京国際フォーラム (東京都千代田区)
  • 年月日: 20130404-20130407