| 研究課題/領域番号 |
24592696
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 九州大学 |
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研究代表者 |
柳 佑典 九州大学, 大学病院, 医員 (30596664)
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| 研究分担者 |
田口 智章 九州大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (20197247)
中山 功一 佐賀大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (50420609)
林田 真 九州大学, 大学病院, 助教 (70452761)
孝橋 賢一 九州大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (10529879)
井原 健二 九州大学, 大学病院, 准教授 (80294932)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | 再生医学 / 肝細胞移植 / 先天性肝疾患 / 乳歯歯髄幹細胞 / 肝組織工学 |
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| 研究概要 |
1) 乳歯歯髄幹細胞(SHED)から肝細胞への分化誘導
SHEDの肝細胞への分化誘導法を確立した。分化した細胞は形態的に肝細胞と類似し、アルブミン、第VIII因子,尿素の産生などの肝特異的特性を有していることを確認した。さらに、このSHED由来肝細胞をヌードマウスの肝臓内に径門脈的に投与しすることで肝臓内に生着し、アルブミン、第VIII因子などを産生することを確認した。
2) SHEDおよびSHED由来幹細胞の免疫寛容性の検討
SHED由来肝細胞をヒトT細胞と共培養すると、HLAの発現が低いために非自己として認識されないだけでなく、T細胞の増殖抑制ならびにアポトーシス誘導効果があることを見出し、免疫寛容性が非常に高いことが示唆された。肝硬変モデルラット（正常免疫）に対してSHEDおよびSHED由来肝細胞を脾臓内投与すると、拒絶されることなく肝臓内に生着することを確認した。
2) 立体的肝細胞構造体の作成
ラット初代肝細胞、正常ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）およびヒト脂肪由来幹細胞(hADSC)を共培養してヘテロスフェロイドを作製することで肝細胞単独よりスフェロイドの形成が早く、機能が向上ことを突き止めた。このヘテロスフェロイを積み上げて1cm3ほどの立体的肝細胞構造体の作製に成功した。特にHUVECを内核に肝細胞、hADSCを外層に配置する二層性ヘテロスフェロイドを作製し用いることで、構造体の機能がより向上することを突き止め、このスフェロイド作成法に関し特許出願を行った（出願番号: 特願2013-056835 出願日: 2013/3/19）。作製した構造体は2週間in vitroで培養すると、正常の肝臓と類似した肝細胞の索状配列や類洞構造が見られることを確認した。機能的にもアルブミンの産生が維持されており、CYP3A4などの肝特異的蛋白の発現を確認した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
研究計画通り、乳歯歯髄幹細胞(SHED)から肝細胞への分化誘導法を確立し、in vitoro,in vivo いずれにもいても肝特異的機能を有することを確認し、SHEDが細胞移植療法に応用可能な細胞ソースであることを確認した。さらには、 SHEDおよびSHED由来肝細胞は免疫寛容性が非常に高く、同種のみならず異種移植においても拒絶されず、安全性が非常に高いことが示唆された。これらの点からSHEDは臨床応用に有用な細胞であると考えられ、疾患モデル動物を用いたSHED細胞移植療法の前臨床試験の準備に入っている。また、ラットの肝細胞を用いて、肝臓に類似した構造と肝特異的機能を持つ1cm3ほどの立体構造体の作製に成功し、我々独自の方法として特許申請を行った。H25年度はSHED由来肝細胞を用いた立体肝細胞構造体を作製し、これを用いた肝再生療法の開発研究を行う予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
1)乳歯幹細胞由来肝細胞を用いた機能的肝立体構造体の製造系の条件確立
乳歯幹細胞由来肝細胞のスフェロイドを作製する。このスフェロイドからロボットシステムを用いて立体構造体を作製する。構造体の細胞の生存率及びアンモニア代謝やアルブミン産生などを指標にin vitroで最適な構造体のデザインを比較検討する。
2) 移植適正部位の検討
マウス大網内、後腹膜内、腎被膜下、背部皮下等に乳歯幹細胞由来肝構造体を移植し、移植体の生着に最適な部位を検討する。移植部位を形態学的（HE染色、PAS染色、各種蛋白質抗体による免疫染色）および生化学的／分子生物学的（RT-PCR法、Western blotting法、ELISA法）に目的とする蛋白質の発現を解析する。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
乳歯幹細胞由来肝細胞の大量培養および乳歯幹細胞由来肝構造体の量産を行うため、主に細胞培養用のサイトカイン、培養器具、培地/培養試薬および実験消耗品の購入を予定している。
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