| 研究課題/領域番号 |
24592719
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| 研究機関 | 慶應義塾大学 |
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研究代表者 |
林 瑠加 慶應義塾大学, 医学部, 助教 (50445392)
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| 研究分担者 |
鳥海 正博 帝京大学, 医学部, 助教 (20528210)
貴志 和生 慶應義塾大学, 医学部, 教授 (40224919)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | 細胞凝集塊 / 非接着培養 / 毛包誘導 / 幹細胞 / 免疫組織学的検討 / 遺伝子学的検討 / 再生医療 / 未分化 |
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| 研究実績の概要 |
C57bl/6J新生仔マウス背部皮膚より線維芽細胞を採取、接着培養にて数継代培養したのち細胞を回収し、寒天でコーティングした超親水性の非接着性培養皿上で、無血清培地を用いて培養を行い、細胞凝集塊を作成した。
細胞の生存に関する検討では、凝集塊形成1週間の段階で95%以上の細胞が生存していた。その後も細胞は培養皿に接着しないながらも長期間生存可能であった。他の凝集塊を作る細胞が、低栄養や低酸素状態で培養することで長期生存が可能であるとの報告もあり、細胞を取り囲む環境の関与が大きく、この際細胞はいわゆる「冬眠」状態であることが予測された。
凝集塊の免疫組織学的検討では、真皮の幹細胞とされるSkpsなどで発現しているSca-1、Nestinなどに関し、細胞凝集塊をhole mountで染色したところいずれの発現も確認されたが、confocal microscopeで観察した切片画像では、マーカーの分布が必ずしも一致しなかった。するとこれらの細胞群は不均等な集団から成ることになるが、これは培養条件により一部の細胞が未分化状態へと移行するのか、もしくは細胞が選択された結果なのか、いずれの可能性も考えられる。今後この解明のために、単一の集団からなる細胞を用いて再検討予定である。
凝集塊の遺伝子発現の検討では、経時的に得たサンプル間で、定量的RT-PCRを用いて相対的な発現変化を調べた。様々な幹細胞において発現が確認されている未分化性を表す膜表面マーカーや転写因子を調べたところ、iPSやMSCなどにおいて認められるSox-2、Oct-4、CD133、cxcr4、などが、細胞凝集塊形成後に二次元培養細胞と比較し、著明に発現上昇した。また毛包再生において重要とされるWntシグナル関連遺伝子の中では、Wnt5a、Wnt5b、βcatenin、Lef-1などの発現が上昇しており、さらに表皮細胞との混合培養を行うとWnt5a、Wnt5bについては凝集塊単独の状態よりも発現上昇することが判明した。
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