| 研究課題/領域番号 |
24592790
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 大阪歯科大学 |
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研究代表者 |
真下 千穂 大阪歯科大学, 歯学部, 講師 (80368159)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | 口腔バイオフィルム / イニシャルコロナイザー / アクチノマイセス / ミュータジェネシス / 遺伝子改変 / バイオフィルム形成関連遺伝子 |
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| 研究概要 |
本研究課題では、歯垢形成の初期段階におけるアクチノマイセス属細菌の働きを明らかにするために、２つの方向性により研究を進めてきた。①Actinomyces oris MG-1株を対象にランダムミュータジェネシスを行い、バイオフィルム形成能欠損した変異株を作製することで、細菌の付着、定着、および他菌種との共凝集に関する新規の遺伝子を同定する。さらに、変異株および変異蛋白の多角的な機能解析により、口腔バイオフィルム形成過程におけるアクチノマイセス属の役割を明らかにする。②アアクチノマイセス属細菌用に開発した遺伝子ツール（プラスミドなど）を作製することにより、①の研究を迅速かつ的確に推し進める。
①の成果では、MG-1株と臨床より分離されたActinomyces oris K20株を対象にトランスポゾンミュータジェネシスを行い変異株プールの作製を行った。変異株プールの中には、異なる形相を示すバイオフィルム形成不全株が存在していた。
②の成果では、現在、アクチノマイセス属で複製が可能なプラスミドであるpJRD215の全塩基配列を決定した。この情報を基にして、Actinomyces orisの遺伝子改変に必要である部位のみを残した（ダウンサイジング）改良型のプラスミドの作製に成功した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
初年度の目標は、以下のように２つの区分で設定した。
１．バイオフィルムを形成するActinomyces orisを対象にトランスポゾンミュータジェネシスを行い、バイオフィルム形成能が変化した変異株を作製する。
本年度は、A. oris MG-1株およびK20株の2株について、バイオフィルム形成不全株を複数作製することができた。当初は、2種（EZ-Tn5とTn31831）のトランスポゾンを用いての変異導入を予定していたが、1種（EZ-Tn5）でしか行えなかったので、次年度も引き続き行う。
２．口腔アクチノマイセス属用ベクターを開発する。
pJRD215内在遺伝子の削除を行い、口腔アクチノマイセス属で効率良く複製可能なクローニングベクターを構築することに成功した。
上記の２つの目標については、概ね順調に研究が進み、その成果を論文投稿と学会発表により報告することができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
初年度においては、当初の目標であった①A. oris MG-1株のバイオフィルム形成不全株プールの作製および②アクチノマイセス属用ベクターの開発に成功した。各々の研究目標における次のステップとしては、①バイオフィルム形成に関連する遺伝子は多数存在すると考えられるので、次年度も引き続き、ランダムミュータジェネシス法によりバイオフィルム形成不全株の作製を行う。ゲノム全体に均一な変異導入がされた変異株プールを作製するために、本年度用いたトランスポゾンとは異なるタイプにのもの（Tn31831）を用いる。さらに、次年度では、変異した遺伝子の機能解析（特にバイオフィルム形成との関連性）に重点をおいて研究を進める。
②本年度は、アクチノマイセス属用の遺伝子改変ツール（プラスミドやトランスポゾンなどを含む）では、本属菌で安定して効率よく複製が可能なプラスミドの作製を行うことができた。しかし、このプラスミドでは、外来遺伝子の発現制御を行うことはできない。次の段階では、既存のシステムで精密に遺伝子の発現制御ができるものを選択し、このシステムをアクチノマイセス用プラスミドに導入することを行う。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
次年度研究費使用内訳（予定）は①A. oris変異株プール作製とその変異遺伝子の解析、②精密な遺伝子発現が可能なアクチノマイセス用プラスミドの作製、および③研究成果報告のための費用に使用する。
具体的には、①細菌の分離・培養に関連する器具および培地の費用、培養装置維持費、トランスポゾン・PCR・RT-PCR・プライマー合成・クローニング用酵素・制限酵素・ベクター・シークエンスなどの費用が含まれる。②プライマー合成・クローニング用酵素・制限酵素・ベクター・シークエンスなどの費用が含まれる。③国内および海外で開催される学会での発表に関わる費用および学術雑誌に投稿する費用が含まれる。
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