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2014 年度 実施状況報告書

低フォスファターゼ症の分子基盤

研究課題

研究課題/領域番号 24592794
研究機関新潟大学

研究代表者

織田 公光  新潟大学, 医歯学系, 教授 (10122681)

研究期間 (年度) 2012-04-01 – 2016-03-31
キーワード低フォスファターゼ症 / 先天性遺伝疾患 / アルカリフォスファターゼ / 発症メカニズム / 石灰化
研究実績の概要

1.低フォスファターゼ症のミスセンス突然変異[TNSALP(G426C)]の解析。
低フォスファターゼ症は組織非特異型アルカリフォスファターゼ(tissue-nonspecific alkaline phosphatase, TNSALP)をコードするALPL遺伝子上の突然変異に起因することが知られている。本年度の研究では、重症の低フォスファターゼ症(乳児型)で報告された426番目のグリシンがシステインに置換したミスセンス変異(ホモ型)の解析を完了した。この突然変異による発症メカニズムを解析するために、野生型酵素並びに変異酵素をほ乳動物細胞に発現して両酵素の詳しい比較検討を行った。その結果、変異酵素を発現した細胞には野生型酵素(2量体で分子サイズ約140 KDa)よりも大きな見かけ上3量体に相当する分子種(約200 KDa)が検出され、その原因が本来架橋されていないサブユニット間が変異酵素ではジスルフィド結合により架橋されていることが分かった。一方、変異酵素は野生型酵素と同じく細胞表面に運ばれるが、全く活性を失っていることも判明した。以上のことから、変異酵素TNSALP (G426C)は細胞表面に発現するが、異常なジスルフィド結合を形成して活性を失っており(loss of function)、このことが本突然変異による重症低フォスファターゼ症の発症の原因であると結論づけられた。

2.TNSALP分子のN-結合糖鎖の役割の解析。
5種類のN型糖鎖の欠失体の中でN413Q欠失体のみは活性がないことが分かっていたが、N413Dなどの解析から、N413の糖鎖の欠失と活性は無関係であり、N (アスパラギン)からQ(グルタミン)への置換が酵素の活性を阻害することを見いだした。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

1.重症の低フォスファターゼ症患者で報告されたミスセンス変異[TNSALP(G426S)]の解析を終了したので投稿の準備をしている。

2.歯限局性の低フォスファターゼ症の患者で報告されたミスセンス変異[TNSALP (P108L)]の解析が完了し論文を投稿中である。

3.TNSALPの5本のN型糖鎖のそれぞれを単独で欠いた酵素(欠失体)の解析から、N型糖鎖は単独では酵素の構造や活性に影響しないことが分かった。一方、TNSALP の5本の糖鎖を全て欠失した酵素では細胞内で顕著に発現量が低下することを見いだしており、糖鎖がタンパク質の生合成や安定性に関与していることが示唆された。

今後の研究の推進方策

1.複数の糖鎖を失った欠失体をコードするプラスミドを構築し、哺乳類細胞に発現して糖鎖の酵素の構造と活性への影響をシステマティックに検討する。

2.重症の低フォスファターゼ症で報告されたTNSALP (D306V)は小胞体で蓄積後に分解されることを報告した。DNAマイクロアレイの解析からこの分解にFbxL13を成分とするユビキチンリガーゼ(SCF)が関与するデータを得ているが、PCRを用いた実験ではその再現性が得られず、今後さらなる検討が必要と思われる。

次年度使用額が生じた理由

変異酵素の詳細な解析のためにはその酵素の発現をコントロールできる安定発現系(Tet-On CHO 細胞)の樹立が必須だが、一部の酵素 [TNSALP(G426S)] でその細胞株を得るのに時間がかかり、本実験まで進まずに解析に用いる予定の経費が余った。

次年度使用額の使用計画

1.細胞が樹立できたので今年度に解析を行う際に用いる。
2.複数の糖鎖を失ったTNSALPの欠失体の構築と塩基配列の決定に経費がかかる。

  • 研究成果

    (9件)

すべて 2015 2014 その他

すべて 雑誌論文 (4件) (うち査読あり 4件、 謝辞記載あり 1件) 学会発表 (4件) 備考 (1件)

  • [雑誌論文] Trans-Golgi protein p230/golgin-245 is involved in phagophore formation.2015

    • 著者名/発表者名
      Sohda M, Misumi Y, Ogata S, Sakisaka S, Hirose S, Ikehara Y, Oda K.
    • 雑誌名

      Biochem Biophys Res Commun.

      巻: 456 ページ: 275-281

    • DOI

      10.1016/j.bbrc.

    • 査読あり / 謝辞記載あり
  • [雑誌論文] A histologic study of deformation of the mandibular condyle caused by distraction in a rat model.2014

    • 著者名/発表者名
      Sakagami N, Kobayashi T, Nozawa-Inoue K, Oda K, Kojima T, Maeda T, Saito C
    • 雑誌名

      Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol.

      巻: 118 ページ: 284-294

    • DOI

      10.1016/j.oooo.

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Hertwig's epithelial root sheath cell behavior during initial acellular cementogenesis in rat molars.2014

    • 著者名/発表者名
      Yamamoto T, Yamamoto T, Yamada T, Hasegawa T, Hongo H, Oda K, Amizuka N.
    • 雑誌名

      Histochem Cell Biol.

      巻: 142 ページ: 489-496

    • DOI

      10.1007/s00418-014-1230-1

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Altered distribution of extracellular matrix proteins in the periodontal ligament of periostin-deficient mice.2014

    • 著者名/発表者名
      Tabata C, Hongo H, Sasaki M, Hasegawa T, de Freitas PH, Yamada T, Yamamoto T, Suzuki R, Yamamoto T, Oda K, Li M, Kudo A, Iida J, Amizuka N.
    • 雑誌名

      Histol Histopathol.

      巻: 29 ページ: 731-732

    • 査読あり
  • [学会発表] ヒトIL-17RA可溶型スプライシングバリアントの同定2014

    • 著者名/発表者名
      相田 美和, 三角 佳生, 田代 康介, 山崎 学, 朔 敬, 織田 公光
    • 学会等名
      第37回日本分子生物学会年会
    • 発表場所
      横浜
    • 年月日
      2014-11-25 – 2014-11-27
  • [学会発表] 副甲状腺ホルモン(PTH)間歇投与の投与量・投与頻度の違いによる骨の細胞群の変化について2014

    • 著者名/発表者名
      山本知真也、長谷川智香、佐々木宗輝、虎谷彌、織田公光、網塚憲生
    • 学会等名
      第56回歯科基礎医学会学術大会・総会
    • 発表場所
      福岡
    • 年月日
      2014-09-25 – 2014-09-27
  • [学会発表] Eldecalcitolは卵巣摘出カニクイザルにおいてミニモデリングによる骨形成を誘導する2014

    • 著者名/発表者名
      6)長谷川智香、山本知真也、織田公光、斎藤一史、網塚憲生
    • 学会等名
      第32回日本骨代謝学会
    • 発表場所
      大阪
    • 年月日
      2014-07-24 – 2014-07-26
  • [学会発表] ビスフォスフォネート連日投与による骨芽細胞・骨細胞への影響について2014

    • 著者名/発表者名
      坪井香奈子、佐々木宗輝、織田公光、北川善政、網塚憲生
    • 学会等名
      第34回日本骨形態計測学会
    • 発表場所
      札幌
    • 年月日
      2014-06-12 – 2014-06-14
  • [備考] 新潟大学大学院医歯総合研究科

    • URL

      http://mds.niigata-u.ac.jp/organization/ols/trr/bio/index_j.html

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公開日: 2016-05-27  

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