| 研究課題/領域番号 |
24592808
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| 研究機関 | 長崎大学 |
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研究代表者 |
岡元 邦彰 長崎大学, 医歯(薬)学総合研究科, 准教授 (10311846)
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| 研究分担者 |
筑波 隆幸 長崎大学, 医歯(薬)学総合研究科, 教授 (30264055)
西下 一久 長崎大学, 医歯(薬)学総合研究科, 助教 (20237697)
坂井 詠子 長崎大学, 医歯(薬)学総合研究科, 助教 (10176612)
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| キーワード | ステロイド / エンドソーム・リソソーム |
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| 研究概要 |
本年度も昨年度に引き続きDexamethasone-induced transcript（以下Dexiと略す）の細胞内局在を調べるためのプラスミドを構築している。Gateway Systemを用いた発現系はHeLa細胞において成功はしたもののその発現量は非常に少なかった。この発現系では生化学および細胞生物学的な解析は難しいと考えたため、遺伝子のC末端に挿入するタグをGFPからFLAGへ変更した。Dexi/GFP遺伝子の発現系が成功しなかった理由は、GFPがDexi遺伝子に対し非常に大きい分子であったことが原因の1つと考えられる。そこで本年度は、C末端にFLAGのタグを組込んだプラスミドをMC3T3-E1細胞へ導入した。この宿主となる細胞は、骨芽細胞様細胞の前駆細胞で、アスコルビン酸、ベータグリセロホスフェイトとデキサメサゾンを培地に添加することで、骨芽細胞へ分化することが知られている。すなわち、デキサメサゾンを加えることで、Dexiの発現が上昇する可能性が十分考えられた。
また、同時に、本研究のきっかけとなった転写因子TFEBのプラスミドも同時に構築を始めた。TFEBを過剰発現させることで、Dexiの発現も増えることが知られているためである。今年度はこれらのプラスミドと2つの遺伝子の過剰発現変異体の作製を行った。発現遺伝子に関しては作製が終了しており、現在過剰発現クローンを得るためにG418を用いたスクリーニングを行っている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
プラスミドの構築までは順調に進んでいたが、細胞への発現系の段階で止まっている。スクリーニングをG418で行い、耐性を持つクローンを採取できるのではあるが、タンパクの発現量がほとんど認められないか非常に少ない。mRNAレベルでは発現を認めるので、タンパク質に翻訳する段階で何らかの障害が起きているのかもしれない。
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| 今後の研究の推進方策 |
現在、Dexi遺伝子の発現を増加させると考えられている転写因子TFEBの遺伝子を構築し、それを発現させている。他の細胞では、この遺伝子の発現は成功しているので、手技的なことか遺伝子上の問題かが判明するものと思われる。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
岡山での学会（歯科基礎医学会）に参加しなかったため。
今年度の福岡での学会（歯科基礎医学会）の参加費として使用する。場合によっては、物品費（試薬あるいは抗体）に使用する。
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