|
本研究の目的は、歯周病原性細菌の感染後の生体内における動態解析を行う事によって、歯周病原性細菌感染に起因する動脈硬化促進メカニズムを解明する事である。当該年度では前年度に引き続き、GFP発現Aggregatibacter actinomyctemcomitans（A.a.）の作製を行った。A.a.のリボゾーム結合配列を含んだロイコトキシンプロモーター（ltxp）とGFP遺伝子領域を大腸菌とA.a.のシャトルベクター（pUmini-Tn5）に挿入し大腸菌DH5alphaに形質転換した。得られたコロニーに関して、シークエンス解析を行った（plasmid７）。次に、大腸菌とA.a.の接合を利用してA.a.700685株を形質転換しようと試みたがうまくいかなかった。従って、plasmid7を精製し、平行してA.a.700685株のコンピテントセルの作製を行った。すなわち、A.a.を1晩培養後2倍希釈して3時間培養し、吸光度600の値が6になるようにpH5.5の緩衝液で濃縮しコンピテントセルとした。A.a.コンピテントセルに、plasmid7をエレクトロポレーション法を用いて導入した。すぐさま液体培地で5時間ローソク培養し、その後A.a.用寒天培地に塗抹し3日間ローソク培養した。生育してきたコロニーを選択培地に塗抹し、2日間ローソク培養後生育してきたコロニーについてスクリーニングを行った。pUmini-Tn5はホストのゲノムに組込まれると、アンピシリン感受性となることから、アンピシリン感受性をテストした。また、染色体を精製し、GFP遺伝子領域をPCRで増幅しサイズ確認した。得られたGFP発現A.a.株をフローサイトメトリーにより解析したところ、野生型A.a.に比較してGFP発現A.a.はGFP強度がわずかに増加した。今後はマウスに感染させ生体内における動態について解析を行っていく。
|
