ＮＫ細胞活性化におけるＩＬ－１７の役割ー炎症の発症機序解明のための解析ー

2012 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 24592853
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 研究機関: 大阪歯科大学
• 研究代表者: 井上 博 大阪歯科大学, 歯学部, 講師 (10330143)
• 研究分担者: 合田 征司 大阪歯科大学, 歯学部, 講師 (70351476)
• 研究期間 (年度): 2012-04-01 – 2015-03-31
• キーワード: NK細胞 / IL-17

研究概要

近年、炎症誘導性サイトカインのIL-17が注目されている。IL-17は獲得免疫だけでなく自然免疫においても種々の細胞に作用して、炎症性サイトカインやケモカインなど種々の因子により炎症を起こすことがわかってきた。NK細胞は、自然免疫に関係しており生体内のウイルス感染細胞などを認識し傷害する。IL-17のNK細胞に対する影響を検討することによって炎症の発症機序解明を進めるために研究を行っている。今年度は以下の研究を行った。
1. NK92細胞の細胞増殖能に対するIL-17の影響：NK92細胞を96穴平底プレートに播種しIL-17を添加後培養した。培養後、細胞増殖試薬WST-1を用いて吸光度を測定することにより細胞増殖能に対するIL-17の影響を検討した。その結果、IL-17はNK92細胞の細胞増殖能に対して影響を及ぼさないことが確認できた。
2. NK92細胞の標的細胞殺傷能に対するIL-17の影響：標的細胞のK562細胞に蛍光物質であるcalcein AMを取り込ませる。NK92細胞とK562細胞の懸濁液をeffector : target 比 (ET比)が20:1になるように混合し、96穴丸底プレートに播種して共培養した。培養後に上清を採取し、放出されたcalcein AMの波長を測定することにより標的細胞殺傷能に対するIL-17の影響を検討した。その結果、NK92細胞は無刺激でもK562細胞と共培養することにより細胞殺傷能を示した。しかし、その細胞殺傷能はIL-17刺激により抑制されることが確認できた。以上の結果より、IL-17によるNK92細胞の細胞殺傷能抑制作用は細胞数減少に伴うものではなく細胞傷害活性の抑制による可能性が示唆された。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

平成24年度の研究実施計画通りに以下の実験を進めることが出来た。
1. NK92細胞の細胞増殖能に対するIL-17の影響。
2. NK92細胞の標的細胞殺傷能に対するIL-17の影響。
その結果、細胞増殖能と標的細胞殺傷能に対するIL-17の影響を確かめることが出来た。

今後の研究の推進方策

細胞内シグナル伝達物質の解明をするためにまず以下の実験を行う。
1. IL-17の最適な刺激時間の決定： 1.ウォーターバス(37℃)を用いてNK92細胞にIL-17の時間的変化（0,1,3,5,15,30,60,120分）による刺激を与える。サンプル作製後ウエスタンブロット法により、各種抗体（Phospho-ERKなど）にてリン酸化状態などを検討し、IL-17の最適な刺激時間を導きだす。
2. IL-17の最適な刺激濃度の決定： 1.で求めた最適な刺激時間でNK細胞に各種濃度(1,5,10,50,100 μg/ml)のIL-17刺激を与える。サンプル作製後ウエスタンブロット法により、各種抗体（Phospho-ERKなど）にてリン酸化状態などを検討し、最適な刺激濃度を導きだす。

次年度の研究費の使用計画

該当なし

研究成果

• [雑誌論文] Effects of JNK on the Production of MMP-3 by Interleukin-1beta-stimulated Human Dental Pulp Fibroblast Like Cells (2013)
  • 著者名/発表者名: Kato Y.
  • 雑誌名: 日本歯科保存学雑誌 巻: 56 ページ: 48-54
  • 査読あり
• [雑誌論文] Effect of IL-17 on osteoclast differentiation of RAW264 cells. (2012)
  • 著者名/発表者名: Sumikura S
  • 雑誌名: J Osaka Dent Univ 巻: 46 ページ: 11-20
  • 査読あり
• [雑誌論文] Mechanisms of NK cell activation stimulated by CD2; granzyme B is released by CD2 crosslinking-stimulation on NK92 cells. (2012)
  • 著者名/発表者名: Inoue H
  • 雑誌名: J Osaka Dent Univ 巻: 46 ページ: 229-235
  • 査読あり
• [雑誌論文] Effect of Akt on the Differentiation into Osteoclasts Caused by RANKL Stimulation. (2012)
  • 著者名/発表者名: Kawasaki T
  • 雑誌名: J Oral Tissue Engin 巻: 10 ページ: 67-76
  • 査読あり
• [学会発表] Effects of JNK on the production of MMP-3 by interleukin-1 beta-stimulated human dental pulp fibroblast like cells. (2012)
  • 著者名/発表者名: 加藤 侑
  • 学会等名: 日本歯科保存学会2012年度秋季学術大会（第137回）
  • 発表場所: 広島国際会議場（広島市）
  • 年月日: 20121122-20121123
• [学会発表] ヒト歯髄由来線維芽細胞におけるIL-1β刺激によるMMP-3 産生への影響． (2012)
  • 著者名/発表者名: 竹内 摂
  • 学会等名: 日本歯科保存学会2012年度秋季学術大会（第137回）
  • 発表場所: 広島国際会議場（広島市）
  • 年月日: 20121122-20121123
• [学会発表] IL-17AがNK細胞の細胞増殖能および細胞傷害能に及ぼす影響について． (2012)
  • 著者名/発表者名: 井上 博
  • 学会等名: 第22回日本歯科医学会総会
  • 発表場所: 大阪国際会議場（大阪市）
  • 年月日: 20121109-20121110
• [学会発表] 破骨細胞前駆細胞RAW264の破骨細胞分化に対するIL-17Aの影響． (2012)
  • 著者名/発表者名: 角倉 紗恵子
  • 学会等名: 第22回日本歯科医学会総会
  • 発表場所: 大阪国際会議場（大阪市）
  • 年月日: 20121109-20121110
• [学会発表] ヒト歯肉由来線維芽細胞に おけるMMP-1産生におよぼすPDGF-bbの影 (2012)
  • 著者名/発表者名: 氏井庸介
  • 学会等名: 第22回日本歯科医学会総会
  • 発表場所: 大阪国際会議場（大阪市）
  • 年月日: 20121109-20121110
• [学会発表] RANKL刺激による破骨細胞分化におけるAktの影響． (2012)
  • 著者名/発表者名: 川崎俊也
  • 学会等名: 第22回日本歯科医学会総会
  • 発表場所: 大阪国際会議場（大阪市）
  • 年月日: 20121109-20121110
• [学会発表] NK92細胞の細胞増殖能および細胞傷害能におけるIL-17Aの影響． (2012)
  • 著者名/発表者名: 大橋 百加
  • 学会等名: 第71回日本矯正歯科学会大会
  • 発表場所: 盛岡市民文化ホール（盛岡市）
  • 年月日: 20120926-20120928
• [学会発表] 破骨細胞前駆細胞RAW264に対するIL-17Aの直接的影響． (2012)
  • 著者名/発表者名: 角倉 紗恵子
  • 学会等名: 第71回日本矯正歯科学会大会
  • 発表場所: 盛岡市民文化ホール（盛岡市）
  • 年月日: 20120926-20120928
• [学会発表] RANKL刺激による破骨細胞分化におけるAkt の影響． (2012)
  • 著者名/発表者名: 川崎俊也
  • 学会等名: 第71回日本矯正歯科学会大会
  • 発表場所: 盛岡市民文化ホール（盛岡市）
  • 年月日: 20120926-20120928
• [学会発表] ヒト歯肉由来線 維芽細胞のMMP-1に及ぼすp38 kinaseの影響． (2012)
  • 著者名/発表者名: 林 寛
  • 学会等名: 第71回日本矯正歯科学会大会
  • 発表場所: 盛岡市民文化ホール（盛岡市）
  • 年月日: 20120926-20120928
• [学会発表] CD2架橋刺激はNK92細胞からのグランザイムB放出を増強する.
  • 著者名/発表者名: 井上 博
  • 学会等名: 第54回歯科基礎医学会学術大会・総会
  • 発表場所: 奥羽大学（郡山市）
• [学会発表] Release of granzyme B from NK92 cells which was crosslinking-stimulated by CD2.
  • 著者名/発表者名: Hiroshi Inoue
  • 学会等名: 第90回日本生理学会大会
  • 発表場所: タワーホール船堀（東京都）
• [学会発表] PDGF-bbが歯肉線維芽細胞に及ぼす影響．
  • 著者名/発表者名: 合田征司
  • 学会等名: 第12回日本抗加齢医学会総会
  • 発表場所: パシフィコ横浜（横浜市）
• [学会発表] AktのRANKL刺激による破骨細胞分化に及ぼす影響
  • 著者名/発表者名: 川崎俊也
  • 学会等名: 第536回大阪歯科学会
  • 発表場所: 大阪歯科大学（枚方市）