| 研究課題/領域番号 |
24593134
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 愛知学院大学 |
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研究代表者 |
三谷 章雄 愛知学院大学, 歯学部, 准教授 (50329611)
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| 研究分担者 |
菊池 毅 愛知学院大学, 歯学部, 講師 (40421242)
相野 誠 愛知学院大学, 歯学部, 助教 (20572811)
石原 裕一 愛知学院大学, 歯学部, 准教授 (50261011)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | IL-17 / Th17 / IL-35 / 歯周炎 |
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| 研究概要 |
歯周病病態でのTh17関連免疫応答におけるIL-35の役割を明らかにすることを目的として、歯周病患者および健常者サンプルを用いて検討している．
平成24年度は、以下の検討を行い、興味深い結果を得ている．①患者および健常者から歯肉溝浸出液を回収し、その中のIL-17の存在をELISAにて確認したところ，歯周病患者では健常者に比べIL-17Aタンパク質が有意に多く検出された．②歯周外科等の際に採取した歯肉組織より凍結切片を作成し，免疫染色にて、歯肉組織中のIL-35の局在同定を試みたところ、歯肉上皮組織にIL-35関連タンパク質（EBI3およびIL-12p35）の発現を多く認め、これは歯周病患者の方が多く発現しているようであった．③歯周外科等の際に採取した歯肉組織より、total RNAを抽出し、real-time PCR解析により、歯肉組織中のIL17AmRNAおよびIL-35関連（EBI3, IL12A）mRNA発現を解析したところ、いずれの遺伝子発現も歯周病患者群において健常者群に比べ優位に上昇していた．④患者および健常者の末梢血を採取し，そこからCD4+T細胞をソーティングし、Th17細胞誘導条件下で４日間培養した．その培養上清中のIL-17Aタンパク質産生を調べたところ、歯周病患者および健常者の間に産生量の有意な差は認めなかった（これに関しては，サンプル数がまだ少なく追加検討する予定である）．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
歯肉溝浸出液中のIL-17の確認をする事で，研究の意義を明確にさせた上で，歯肉組織中のmRNA発現解析を行えた。さらに、歯肉中のIL-35関連タンパクとしてのEBI3やIL-12p35の免疫染色が行えた．また、末梢血由来細胞よりTh17細胞誘導を行い，IL-17検出を行い始めており，おおむね順調に進行していると考える．しかしながら、サンプルが患者および健常者からの採取になるため，時間を要すると考えられ，今後、場合によっては進捗が遅れる可能性も考えられる．．
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| 今後の研究の推進方策 |
引き続き平成25年度では、⑤患者末梢血由来Th17細胞におけるIL-17発現量および産生能の解析（MACSによるTh17細胞分離後，IL-17 secretion assayおよびreal-time PCR解析を行う）、⑥患者および健常者の末梢血由来CD4+T細胞から誘導できたTh17細胞のIL-17産生能の解析（MACSによるCD4+T細胞分離後，Th17誘導環境下で４日間培養後、Th17細胞として回収．その後，IL-17 secretion assayを行う）、⑦患者末梢血由来Th17細胞に対するrIL-35の影響の解析（MACSによるTh17細胞分離後，rIL-35を添加して培養しcytokine FACSおよびIL-17 ELISAを行う）、⑧歯周病原性細菌によるIL-17産生T細胞ポピュレーションに及ぼすIL-35の役割の検討（MACSによるCD4+T細胞分離後，Th17誘導環境下で４日間培養後、Th17細胞として回収．その後，抗原提示細胞とPorphyromonas gingivalisあるいはAggregatibacter actinomycetemcomitansと共に培養する．rIL-35を添加し，細胞増殖活性やreal-time PCR解析（IL-17、IL-10、IL-5、IFNγ、RORγt、Foxp3、T-bet、GATA3等）、cytokine FACSを行う）、を順次行い、その結果を解析し、総合的に評価・考察する計画である．
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| 次年度の研究費の使用計画 |
今後の研究を進めるために，主に消耗品に使用する予定である．具体的には，培養に必要なフラスコ・メディウム・FCS・チップ類，MACSソーティングに必要なカラム、抗体およびバッファー類、Th17細胞誘導に必要なリコンビナントサイトカイン・抗体類、PCRに必要な試薬・プライマー類、細胞増殖活性測定試薬等である．その他に、研究の情報交換も兼ねた海外等の学会発表における旅費にも使用する予定である。
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